以下小編列舉三篇成功案例，解析群體在QTL定位中的應(yīng)用。

當(dāng)我們針對一群體，關(guān)注性狀較多時，可參照案例一，整篇文章通過群體圖譜構(gòu)建，QTL定位后幾乎沒有驗證工作，可以幫我們拿到一個群體QTL的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

案例一

發(fā)表期刊：Plant Physiology and Biochemistry

影響因子：6.1

合作單位：江蘇省徐淮區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部甘薯生物學(xué)與遺傳改良重點實驗室

實驗方法：Xin24×Yushu10雜交中選擇212個F1材料: 特異性位點擴(kuò)增片段測序（SLAF-seq）；遺傳圖譜構(gòu)建；數(shù)量性狀位點（QTL）定位；GWAS關(guān)聯(lián)（F1群體）

表型檢測：多年多表型收集

百邁客生物為該研究提供了群體測序及部分?jǐn)?shù)據(jù)分析服務(wù)。

甘薯作為一個全球重要的作物，其含有豐富的營養(yǎng)成分以及對不同環(huán)境的適應(yīng)能力。然而，由于其自交不親和，高雜合度等特性，使其遺傳特征的研究相對較少。作者從Xin24×Yushu10雜交中選擇212個F1材料，SLAF-seq測序，獲得親本26.73×，子代52.25×的測序數(shù)據(jù)，依據(jù)SNP及百邁客生物自主研發(fā)的HighMap構(gòu)圖軟件，生成一個長度為2441.56 cM、平均圖距為0.51 cM的遺傳圖譜。

基于連鎖圖譜，鑒定出26個QTL，解釋了6.3-10%的表型變異，包括6個最長藤蔓長度 QTL、6個單株產(chǎn)量 QTL、10個干物質(zhì)含量QTL、1個淀粉含量 QTL、一個可溶性糖含量QTL和2個類胡蘿卜素含量QTL。該研究結(jié)果對甘薯的標(biāo)記輔助育種和基因克隆具有重要意義。

圖1-表型檢測

圖2-遺傳圖譜構(gòu)建

圖3-QTL定位

前文是對多個性狀的連鎖分析，當(dāng)我們關(guān)注單個性狀時，BSA無疑是高性價比的初定位選擇，當(dāng)然，這就意味著我們得做到基因的精細(xì)定位與克隆，除去傳統(tǒng)圖位克隆的方式，轉(zhuǎn)錄組，蛋白組，自然群體GWAS，基因組都可助力基因克隆，如果想發(fā)高水平的文章，基因的功能探索也是必不可少的。

成功案例二

發(fā)表期刊：Plant Biotechnology Journal

影響因子：10.1

發(fā)表單位：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)

實驗方法：莢果大小/重量差異顯著2份Virginia-type花生材料( ND _ L和ND _ S)雜交，產(chǎn)生遺傳群體；F2:3群體BSA-seq（20+20混池）；F6:7 和F6:8群體精細(xì)定位；基因克隆；系統(tǒng)進(jìn)化分析；亞細(xì)胞定位；免疫熒光；酵母雙雜交；pull-down；CO-IP；番茄擬南芥轉(zhuǎn)化實驗等。

百邁客生物為該研究提供了群體測序及部分?jǐn)?shù)據(jù)分析服務(wù)。

花生莢果大小是決定花生產(chǎn)量的關(guān)鍵農(nóng)藝性狀，為了鑒定控制花生莢果大小的基因，該研究對188份核心種質(zhì)進(jìn)行鑒定，并選取莢果大小/重量差異顯著的2份花生材料構(gòu)建F2群體，BSA-Seq獲得了288.58 Gb的原始數(shù)據(jù)。利用285914個高質(zhì)量SNPs 和70 759個 InDel，將控制莢果大小的基因定位在07染色體1.17 Mb的區(qū)間內(nèi)。作者從F6：7和F6：8群體中開發(fā)了15個多態(tài)性標(biāo)記并對個體進(jìn)行基因分型，精細(xì)定位QTL到KASP 9 和In Del15之間20.4 kb的區(qū)間內(nèi)。該區(qū)間僅包含1個預(yù)測的非同義突變基因和InDels，將該基因命名為PSW1。

PSW1編碼一個LRR – RLK蛋白激酶，等位基因PSW1HapII賦予了PSW1更高的表達(dá)水平和對其輔助受體AhBAK1更強(qiáng)的親和力，以上調(diào)PSW1 – based途徑，調(diào)節(jié)花生莢果大小。此外，PSW1HapII的過表達(dá)增加了多種植物的種子/果實大小。

圖4-表型檢測

圖5-BSA分析

當(dāng)然，如果想讓我們的文章影響因子再上一臺階，兼顧群體的“廣度”和“深度”，是更好的選擇。

成功案例三

發(fā)表期刊：Nature?Genetics

影響因子：30.8

發(fā)表單位：浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院等

實驗方法：菜用豇豆G98，糧用豇豆G323 基因組Denovo；重測序GWAS：344份全世界收集的豇豆核心種質(zhì)，其中包括342份栽培豇豆（87份糧用豇豆、244份菜用豇豆和11份未知用途豇豆）和2份野生豇豆；Illumina測序，10x深度；基因單倍型驗證：菜用豇豆地方品種 ‘ZN016’ 和菜用豇豆育成品種‘Zhijiang282構(gòu)建的RIL群體（183 lines）G98和G323構(gòu)建的F2群體（165 individuals）

百邁客生物為該研究提供了群體測序、基因組測序及部分?jǐn)?shù)據(jù)分析服務(wù)。

豇豆起源于非洲，在世界范圍內(nèi)作為糧食、蔬菜或牲畜飼料種植。該研究結(jié)合PacBio、Hi-C和二代測序，組裝了糧用豇豆和菜用豇豆的染色體水平基因組。對包括地方品種、野生品種和育成品種的344個材料進(jìn)行二代測序，以闡明豇豆基因組的系統(tǒng)進(jìn)化。

為了研究自然或人工選擇對豇豆分化的影響，作者通過選擇清除分析比較了三個豇豆亞群之間的基因組選擇特征，鑒定出239個與豇豆馴化和改良相關(guān)的基因。此外，通過GWAS，挖掘到裂莢性、莢長、單莢粒數(shù)、千粒重、可溶性糖、總淀粉和粗蛋白質(zhì)含量相關(guān)基因，并在遺傳群體中驗證。同時揭示了兩個亞種之間基因組結(jié)構(gòu)變異（SVs）的全圖譜，為豇豆在全基因組選擇下的馴化與改良提供了見解。產(chǎn)量性狀和品質(zhì)性狀的差異基因組選擇將有助于建立糧用豇豆和菜用豇豆雙向改良的遺傳資源。

圖6-群體選擇與GWAS分析

今日分享結(jié)束，期待下期精彩內(nèi)容~~~

發(fā)表期刊：Poultry Science

影響因子：3.8

發(fā)表單位：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，西藏農(nóng)牧學(xué)院等

研究對象：金陵白鴨

研究方法：全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）

百邁客生物為該研究提供了全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）測序及部分?jǐn)?shù)據(jù)分析服務(wù)。

研究背景

鴨子為人類消費提供肉、蛋、羽毛等產(chǎn)品，中國是世界上最大的鴨肉消費國。金陵白鴨做為我國優(yōu)質(zhì)的選育品種，具有優(yōu)良的生長速度和肉質(zhì)品質(zhì)。從孵化到上市的整個時期，鴨子的體重逐漸增加，這一過程由復(fù)雜的生理和生化機(jī)制調(diào)控，器官和骨骼的發(fā)育是體重增加的關(guān)鍵因素，全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）是許多牲畜和家禽物種研究生長和發(fā)育的遺傳機(jī)制的常用方法，然而，現(xiàn)有的一些關(guān)于鴨生長發(fā)育性狀的GWAS研究測序深度較低，發(fā)現(xiàn)的候選基因很少。

材料方法

201只雄鴨全基因組測序深度為10×；

GWAS分析：表型：出生體重（BWB）、1周體重（BW1）、3周體重（BW3）、5周體重（BW5）和7周體重（BW7）分析模型：FaST-LMM；EMMAX；LMM；LM 閾值線：log10(p)=5如果一個SNP在2個或更多的模型中被關(guān)聯(lián)，作者認(rèn)為它是一個與特定性狀相關(guān)的高可信度SNP。

進(jìn)化分析：進(jìn)化樹構(gòu)建；群體結(jié)構(gòu)分析；PCA分析；LD衰減分析等

研究結(jié)果

1.金陵白鴨群體體重表型統(tǒng)計

該研究對金陵白鴨（n = 201）在不同時期的體重進(jìn)行統(tǒng)計，BWB、BW1、BW3、BW5和BW7的體重均值分別為46.93g、127.19g、697.17g、1182.43g和1,888.52g。生長曲線結(jié)果顯示：金陵白鴨第3周-第5周生長最快，第5周后生長放緩。體重的分散度隨著年齡和體重的增加而增加。相鄰2周的體重之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性，BW3與BW1（r = 0.6）、BW5（r = 0.68）和BW7（r = 0.6）顯著正相關(guān)，BW5與BW7顯著正相關(guān)（r = 0.82）。但隨著時間間隔的延長，性狀間的相關(guān)性降低，BW1與BW7的相關(guān)性不顯著（r = 0.21），BWB則與BW3 (r = 0.18)， BW5 (r = 0.058)，BW7 (r = 0.45)均不顯著相關(guān)。

圖1-表型分析

2.金陵白鴨系統(tǒng)發(fā)育、群體遺傳結(jié)構(gòu)解析

雖然該研究只有金陵白鴨一個種群，但考慮到繁殖過程中種群分層的潛力，作者進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育和群體結(jié)構(gòu)分析。系統(tǒng)發(fā)育樹和PCA結(jié)果顯示，金陵白鴨可分為5個種群，群體結(jié)構(gòu)表明，當(dāng)K=6時分群結(jié)果最佳，金陵白鴨種群具有豐富的遺傳多樣性，總SNPs的平均R2為0.24，當(dāng)R2=0.2，LD的衰減距離約為30kbp。

圖2-群體進(jìn)化分析

3.GWAS分析

該研究對基于測序產(chǎn)生的2,610.50 Gbp的clean data進(jìn)行分析，Q30為95.55%，樣本與參考基因組平均比對率為99.59%，平均覆蓋深度為10×，基因組覆蓋度為96.51%。作者利用，797,309,337個SNPs，4種關(guān)聯(lián)模型進(jìn)行后續(xù)GWAS分析，其中95個SNP與BWB性狀顯著相關(guān)，這些SNP主要分布在1號染色體和4號染色體上。通過篩選和注釋，共檢測到5個相關(guān)的候選基因：PUS7、FBXO11、FOXN2、MSH6、SLC4A4。針對BW1性狀，作者發(fā)現(xiàn)了101個與BW1性狀顯著相關(guān)的SNPs，這些SNP主要分布在7號染色體上，共檢測到2個與BW1性狀相關(guān)的候選基因：RAG2和TMEFF2。針對BW3性狀，作者發(fā)現(xiàn)了112個顯著SNPs。這些SNP主要分布在1號染色體和11號染色體上。通過篩選和注釋，共檢測到4個與BW3性狀相關(guān)的候選基因：?STARD13、Klotho、ZAR1L和TLE3。同時確定了92個與BW5性狀相關(guān)SNPs，這些SNP主要分布在1號染色體和2號染色體上，通過注釋STARD13、Klotho和ZAR1L與BW5性狀相關(guān)。此外，作者還鑒定了新的候選基因：KAT2B、KCNH8和SATB1。

BW7性狀與33個SNP關(guān)聯(lián)，這些SNP主要分布在1號染色體和2號染色體上。通過篩選和注釋，共檢測到6個與BW7性狀相關(guān)的候選基因：PLXNC1、ATP1A1、CD58、FRYL、OCIAD1和OCIAD2。在分析的四個模型的結(jié)果，LM識別出了更多的顯著位點，曼哈頓圖顯示出更高的峰值。然而，QQ-plot顯示，LM模型中的大部分站點都位于對角線上方，可能具有較高的假陽性。其余3個模型的結(jié)果均表現(xiàn)出一致性，而QQ-plot的結(jié)果則優(yōu)于LM模型。

圖3-GWAS分析

研究總結(jié)

金陵白鴨是一種新開發(fā)的品種，因其生長速度快，肉質(zhì)優(yōu)良的特點，使其具有重要的經(jīng)濟(jì)價值和研究潛力；然而，人們對其體重性狀的遺傳基礎(chǔ)尚不太清楚。該研究對201只金陵白公鴨進(jìn)行了全基因組重測序，并進(jìn)行了群體基因組分析，表明金陵白鴨種群具有豐富的遺傳多樣性。

作者對出生體重（BWB）、1周體重（BW1）、3周體重（BW3）、5周體重（BW5）和7周體重（BW7）進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，4種統(tǒng)計模型比較研究表明，F(xiàn)aST-LMM表現(xiàn)出最優(yōu)的效率，產(chǎn)生更多的結(jié)果和最小的假陽性。

作者發(fā)現(xiàn)，PUS7、FBXO11、FOXN2、MSH6和SLC4A4均與BWB相關(guān)。RAG2和TMEFF2是BW1的候選基因，STARD13、Klotho、ZAR1L可能是BW3和BW5的候選基因。PLXNC1、ATP1A1、CD58、FRYL、OCIAD1和OCIAD2與BW7相關(guān)。這些研究結(jié)果為金陵白鴨的選擇和育種提供了遺傳參考，同時也加深研究者們對白鴨生長發(fā)育表型的認(rèn)識。

沈陽醫(yī)學(xué)院高兵教授團(tuán)隊在?Redox Biology?雜志發(fā)表題為“ Meta-data analysis of kidney stone disease highlights?ATP1A1?involvement in renal crystal formation ”?的研究論文，結(jié)合全外顯子測序與轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)數(shù)據(jù)分析，解釋ATP1A1在腎晶體形成中起到的重要作用，表明ATP1A1可能是治療鈣結(jié)石的潛在治療靶點。ong>

英文標(biāo)題：Meta-data analysis of kidney stone disease highlights?ATP1A1?involvement in renal crystal formation

中文標(biāo)題：腎結(jié)石病的Meta數(shù)據(jù)分析揭示ATP1A1參與腎晶體形成

發(fā)表期刊：Redox Biology

合作單位：沈陽醫(yī)學(xué)院

影響因子：10.7

研究對象：CaOx腎結(jié)石患者及對照組樣本

研究方法：全外顯子測序（WES）+表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析

百邁客生物為該研究提供了外顯子測序服務(wù)。

研究背景

腎結(jié)石在全球范圍內(nèi)都威脅著人類的生命健康，近年來發(fā)病率和復(fù)發(fā)率都不斷上升，大多數(shù)腎結(jié)石由草酸鈣（Calcium ox）結(jié)石組成，晶體-細(xì)胞粘附被認(rèn)為是晶體保留和結(jié)石形成中的關(guān)鍵步驟，有研究報道，受損的腎小管上皮細(xì)胞對晶體附著的親和力增加，而晶體沉積通過產(chǎn)生過多的活性氧（ROS）反過來又誘導(dǎo)細(xì)胞損傷和炎癥反應(yīng)。Na/K-ATPase（NKA）是一種在腎臟中高度表達(dá)的跨膜離子泵，同時其由ATP1A1編碼的α1亞基也起到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)器的作用，當(dāng)?ATP1A1?構(gòu)象改變或被敲低時，Src 就會被磷酸化并激活下游信號級聯(lián)，進(jìn)而導(dǎo)致 ROS 的產(chǎn)生，ROS可以激活MAPK級聯(lián)反應(yīng)和NF-κB炎癥反應(yīng)，并作為ATP1A1的配體啟動ATP1A1/Src信號通路，從而形成NKA/ROS擴(kuò)增環(huán)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，然而，ATP1A1在腎結(jié)石形成中的作用尚不清楚。本實驗結(jié)合多組學(xué)分析方法，以期提供一種有用的方法，研究腎結(jié)石形成病理。

材料方法

實驗材料：28例中國漢族CaOx腎結(jié)石患者及對照組樣本

組學(xué)方法：全外顯子測序（WES）+表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析

研究結(jié)果

首先該研究從GEO數(shù)據(jù)中獲取了腎臟鈣結(jié)石患者的表達(dá)譜數(shù)據(jù)化，其中患者的RP組織（Randall斑塊）命名為P組，患者的正常組織命名為N組，對其表達(dá)譜篩選基因進(jìn)行WGCNA分析，選擇與樣本相關(guān)性較高的淺橙色模塊（434個基因）進(jìn)行后續(xù)研究，GO富集結(jié)果表明這些基因在質(zhì)膜和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中富集。KEGG富集分析顯示，這些基因參與“醛固酮調(diào)節(jié)的鈉重吸收”、“礦物質(zhì)吸收”、“內(nèi)分泌等因子調(diào)節(jié)的鈣重吸收”和“近端小管碳酸氫鹽回收”等通路，進(jìn)一步查看發(fā)現(xiàn)，FXYD2、FXYD4、ATP1A4、ATP1A1和ATP1B1等5個編碼NKA的基因參與了跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、吸收和重吸收的過程，表明NKA可能與腎結(jié)石密切相關(guān)。

為進(jìn)一步探究腎結(jié)石相關(guān)關(guān)鍵基因，該研究對28例中國漢族CaOx結(jié)石患者進(jìn)行了WES分析，共鑒定得到76個SNPs，其中錯義SNPs31個，編碼同義SNPs30個，3′UTR7個SNPs，5′UTR區(qū)8個SNPs，作為候選SNPs，這些突變位點定位于67個基因，將這67個基因與WGCNA分析中的434個基因做韋恩圖取交集，發(fā)現(xiàn)ATP1A1是兩個數(shù)據(jù)集交叉點中的唯一基因，一定程度上說明了ATP1A1在鈣結(jié)石形成中的潛在作用。

接下來，該研究從WES數(shù)據(jù)中提取了ATP1A1的SNP，rs11540947 T等位基因在患者組中的突變頻率頻率為16.1%，而對照組僅為2.4%。為進(jìn)一步證實rs11540947與鈣結(jié)石形成的相關(guān)性，收集214例鈣結(jié)石患者和232例匹配對照，通過HRM分析檢測rs11540947的基因型，結(jié)果顯示，CT+TT攜帶者在患者中比對照組更常見，且在男性中與鈣結(jié)石有關(guān)，但在女性中無顯著相關(guān)性，SNPrs11540947 （NM_000701:c.-78C > T）位于?ATP1A1?的 5′UTR 中；在ATP1A1的5′UTR中發(fā)現(xiàn)了Sp1結(jié)合位點和潛在的TATA盒，表明5′UTR具有啟動子活性，雙熒光素酶報告基因結(jié)果也證明了這一點，rs11540947的T等位基因介導(dǎo)了ATP1A1啟動子活性的顯著降低，這可能會降低ATP1A1在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。對草酸鈣一水合物（COM）暴露處理的HK2細(xì)胞（人腎近曲小管上皮細(xì)胞）進(jìn)行指標(biāo)測定，結(jié)果顯示處理3h后，NKA酶活性和ATP1A1 mRNA水平顯著下降，6h后ATP1A1的蛋白水平升高，隨后降低，同時COM 暴露后細(xì)胞內(nèi) ROS 水平顯著增加，這可能與ATP1A1/Src信號通路的激活有關(guān)，而ATP1A1的過表達(dá)抑制了COM誘導(dǎo)的Src、p38、JNK、p65和p50激活；WB結(jié)果也顯示COM激活的半胱天冬酶3被ATP1A1的過表達(dá)以及ATP1A1/Src信號復(fù)合物的特異性拮抗劑pNaKtide顯著抑制，從而阻斷了細(xì)胞凋亡過程。

晶體與細(xì)胞的粘附是結(jié)石形成的關(guān)鍵過程，晶體沉積會損傷腎細(xì)胞，因此，作者研究了ATP1A1在晶體-細(xì)胞粘附中的作用。該研究觀察到用 Ad-hATP1A1 感染和用 pNaKtide 處理后，Ca²⁺濃度與對照組相比顯著降低，表明ATP1A1過表達(dá)和pNaKtide可以阻止晶體與細(xì)胞的粘附，從而保護(hù)細(xì)胞免受CaOx晶體誘導(dǎo)的損傷并減少腎結(jié)石的形成。DNA啟動子中CpG島的甲基化是基因沉默的常見機(jī)制，COM暴露后，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMTs）的mRNA和蛋白質(zhì)水平均顯著升高，而用DNA甲基化抑制劑5Aza-2dc預(yù)處理HK2細(xì)胞再進(jìn)行COM暴露處理后，ATP1A1表達(dá)量下調(diào)；ATP1A1的蛋白水平也被逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明，改變的DNA甲基化參與了COM誘導(dǎo)的ATP1A1降低。

為了證實ATP1A1對體內(nèi)晶體形成的影響，該研究構(gòu)建了CaOx腎病大鼠模型，用 pNaKtide 治療后尿草酸鹽排泄量顯著減少，與體外研究結(jié)果類似，HYP+CaCl2處理降低了 ATP1A1 mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，激活了 Src、p38、JNK、p65 和 p50，降低 Nrf2 表達(dá)，而這些均被pNaKtide逆轉(zhuǎn)，這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了ATP1A1和ATP1A1/Src信號通路在腎結(jié)石形成中的重要性。

研究總結(jié)

綜上所述，該研究從遺傳水平和環(huán)境因子影響的轉(zhuǎn)錄水平探究腎結(jié)石相關(guān)關(guān)鍵易感基因，將鈣結(jié)石形成者Randall斑塊（RP）組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)與CaOx患者的WES數(shù)據(jù)相結(jié)合，鑒定出ATP1A1這一關(guān)鍵基因，還研究了ATP1A1遺傳變異與鈣結(jié)石風(fēng)險的關(guān)聯(lián)，并進(jìn)一步探討了ATP1A1/Src/ROS信號在體外和體內(nèi)腎結(jié)石形成中的作用，這項研究的發(fā)現(xiàn)揭示了ATP1A1基因變異及其表達(dá)降低參與腎晶體形成的機(jī)制，可能為CaOx結(jié)石提供潛在的治療靶點。

參考文獻(xiàn)：

Li Y, Lu X, Yu Z, Wang H, Gao B. Meta-data analysis of kidney stone disease highlights?ATP1A1?involvement in renal crystal formation.?Redox Biol. 2023 May;61:102648. doi: 10.1016/j.redox.2023.102648. Epub 2023 Feb 27. PMID:36871182.

該研究以瓢雞和仙居雞為親本建立回交家系，以探索瓢雞無尾特征的遺傳機(jī)制和分子基礎(chǔ)。通過全基因組關(guān)聯(lián)和連鎖分析，研究人員將無尾性狀的候選區(qū)域精確定位到798.5 kb的區(qū)間內(nèi)（chr2:86.9-87.7 Mb）。

通過對包含家系內(nèi)特殊基因型個體的突變位點進(jìn)行綜合篩選和分析后，一個4.2 kb的缺失被確定與瓢雞的無尾表型完全相關(guān)。在對致因區(qū)間內(nèi)的基因表達(dá)結(jié)果進(jìn)行深入探究后，一個全新的基因Rum（長度大于22 kb，無內(nèi)含子），其表達(dá)呈現(xiàn)出無尾表達(dá)缺失，雜合子是顯性純合子表達(dá)量的一半的現(xiàn)象。深入研究發(fā)現(xiàn)Rum的表達(dá)具有胚胎特異性，研究人員認(rèn)為Rum的表達(dá)缺失以及雜合子中的單倍劑量不足，使其無法正常調(diào)控MSGN1基因長轉(zhuǎn)錄本以及TBX6等基因的正常表達(dá)，進(jìn)而使得尾部骨骼發(fā)育出現(xiàn)異常。

瓢雞無尾表型的定位區(qū)間，與之前報道的美國阿勞卡納雞品種無尾表型區(qū)間非常接近但精細(xì)定位區(qū)間沒有重疊。對瓢雞、阿勞卡納以及其他具有正常尾巴的多個種群的群體基因組分析顯示，雖然這兩個無尾品種在2號染色體的相同區(qū)域受到選擇，但選擇具有品種差異性。在阿勞卡納雞2號染色體上識別的兩個候選SNP在無尾瓢雞中并不存在，并且在瓢雞中證實的致因缺失突變在阿勞卡納雞也不存在。即瓢雞和阿勞卡納雞無尾特征可能源自不同的致病突變。

值得注意的是，阿勞卡納和瓢雞是遺傳上獨特的品種，兩者沒有共同祖先。瓢雞源自中國云南，阿勞卡納起源于智利后引入美國。兩種無尾雞在外觀表型上也有所不同，包括體型、耳簇和蛋殼顏色等。在當(dāng)前的研究中，確認(rèn)了這兩個品種特有的致因突變存在。因此，如果這些不同的遺傳背景導(dǎo)致了相同的表型，這意味著自然已經(jīng)進(jìn)化出了替代的遺傳解決方案來實現(xiàn)所需的表型特征。這種遺傳路徑的冗余匯聚形成了共同的表型，是進(jìn)化多樣性的顯著例證。

研究發(fā)現(xiàn)了瓢雞無尾的致因突變和關(guān)鍵基因，揭示了關(guān)鍵基因的作用方式。這項研究不僅增進(jìn)了我們對于雞骨骼發(fā)育調(diào)控的理解。還強(qiáng)調(diào)了遺傳演化和適應(yīng)性的動態(tài)本質(zhì)，是鳥類遺傳和進(jìn)化研究領(lǐng)域的又一突破性的發(fā)現(xiàn)。

 

期刊：Nature Genetics

IF：30.8

時間：2023年 7月

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作者通過秈稻品種特青和粳稻品種02428構(gòu)建高級遺傳群體克隆了產(chǎn)量相關(guān)基因GY3，其啟動子區(qū)域的反轉(zhuǎn)座子插入增強(qiáng)了啟動子區(qū)域的表觀修飾，降低GY3表達(dá)量，從而減少細(xì)胞分裂素合成前體底物的無效消耗，提高體內(nèi)活性的細(xì)胞分裂素含量，增加每穗粒數(shù)和谷物產(chǎn)量。GY3可作為后期秈稻高產(chǎn)育種的重要目標(biāo)基因，推動產(chǎn)量提升。

野生八倍體草莓單倍型基因組解析

期刊：Nature Plants

IF：18.0

時間：2023年7月

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該研究報道了兩個八倍體野生草莓智利草莓 (F. chiloensis)和弗州草莓 (F. virginiana)染色體水平的高質(zhì)量分型基因組組裝。探討了八倍體草莓在馴化過程中的同源偏向性表達(dá)分化，并鑒定到了一些重要的轉(zhuǎn)錄因子在馴化過程中發(fā)生了表達(dá)轉(zhuǎn)變。此研究深度解析了草莓的起源、基因組進(jìn)化和馴化。（百邁客參與測序工作·）

橡膠樹基因組解析助力馴化研究

期刊：Nature Communications

IF：16.6

時間：2023年7月

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作者利用PacBio CLR＋BioNano＋Hi-C的方法構(gòu)建了橡膠樹參考基因組，結(jié)合127個栽培和208個野生品種重測序數(shù)據(jù)對其馴化的分子機(jī)制解析，同時通過208份橡膠樹種質(zhì)材料進(jìn)行GWAS分析，鑒定到一個調(diào)控乳管數(shù)量的馴化基因。此研究將為后期橡膠樹的高產(chǎn)育種提供了分子基礎(chǔ)。

被子植物6大器官模式圖

1、在與研究目的不沖突的前提下，盡量選取新鮮、幼嫩、生長狀態(tài)良好的組織部位。植物組織越幼嫩新鮮所含的次生代謝產(chǎn)物就越少，隨著植物組織的逐漸成熟，次生代謝產(chǎn)物的含量會逐漸增多，而次生代謝產(chǎn)物的存在會影響核酸的提取效果，次生代謝產(chǎn)物越多，核酸提取越困難，得率也越低。

2、如果植物組織表面污漬較多，在采集之前應(yīng)迅速用預(yù)冷的純凈水或75%乙醇擦拭或沖洗干凈，再用吸水紙吸干組織表面殘留液體。

3、將處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL或更大體積的旋蓋凍存管中。

4、建議10min中內(nèi)（越快越好）置于液氮中冷凍1h以上，然后轉(zhuǎn)移至-80℃長期保存，干冰運(yùn)輸。

1）提前準(zhǔn)備好冷凍組織的足量液氮，預(yù)裝樣品的凍存管，并在做好標(biāo)記（盡量不使用漢字命名，命名字符控制在5個以內(nèi)）

2）活體取下新鮮組織，立即剔除結(jié)締組織等非研究所需的組織類型。對腫瘤組織的取材，應(yīng)盡可能準(zhǔn)確地判定腫瘤和正常組織，腫瘤組織應(yīng)將周圍的正常組織切除干凈（正常組織也應(yīng)周圍的腫瘤組織切除干凈），腸道組織一定要把內(nèi)容物清洗干凈；

3）迅速用預(yù)冷的PBS溶液（RNase free）或0.9%生理鹽水將組織表面的殘留血液沖洗干凈

4）如果組織體積較大，將組織切成長寬高均≤0.5 mm 的小塊（即黃豆大?。?/p>

5）將凍處理好的組織樣本混合均勻后保存于2 mL 或更大體積的螺口凍存管（RNase free）中，標(biāo)注編號。

6）立即（20s內(nèi)）置于液氮中冷凍 3~4 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存

7）干冰運(yùn)輸。

2）震蕩混勻，常溫裂解 5 min 后，使用低溫離心機(jī)12000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)至新的2.0ml離心管中（拍質(zhì)控照片，方便核查），轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，運(yùn)輸時選擇干冰寄送。

2）如果組織帶血液或其他體液，需要過夜后更換一次RNAlater??Solution；不要將剛浸入RNAlater Solution中的樣本立即冷凍，需將樣本置于4 °C 保存過夜（使Solution充分浸潤組織樣本），然后轉(zhuǎn)移至-20 °C 或-80 °C 長期保存；

3）RNAlater??Solution 不會影響組織結(jié)構(gòu)，可以把已保存的組織從 RNAlater??Solution中取出，切下實驗所需的用量，把剩余的組織再放入到原來的保存液中繼續(xù)保存；

4）保存于RNAlater??Solution中樣本，-20 °C 存放時，樣本不會結(jié)凍，但可能會有晶體析出，這并不影響后續(xù)的 RNA 提取工作；-80 °C 存放時，樣本會結(jié)凍， 在進(jìn)行 RNA 提取前，需置于冰上融化再進(jìn)行后續(xù)操作，解凍后的樣本可再次放入-80 °C 保存；

5）一般來講，生物樣本保存于RNAlater??Solution中，37 °C可存放1天，25 °C（室溫）可存放1周，4 °C 可存放1個月，-20 °C 或-80 °C 可長期保存。但鑒于生物樣本的特殊性及實驗可重復(fù)性，建議所有保存于RNAlater??Solution中樣本，都要置于-20 °C 或-80 °C 長期保存。

1）顯微鏡下觀察細(xì)菌生長狀態(tài)，盡量收集生長期處于對數(shù)期的細(xì)菌。

2）將適量體積的菌液轉(zhuǎn)移至2 mL 旋蓋尖底離心管（無菌，無核酸酶）中，于室溫下14000 ×g 離心1 min。

3）棄掉培養(yǎng)基，將細(xì)菌菌體沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存。

4）將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運(yùn)輸。

1）顯微鏡下觀察酵母菌生長狀態(tài)，盡量收集生長期處于對數(shù)期的酵母菌。

2）將適量體積的酵母菌液轉(zhuǎn)移至將2 mL旋蓋尖底離心管中（無菌，無核酸酶），于室溫下14000×g 離心1 min。

3）棄盡培養(yǎng)基，將酵母細(xì)胞沉淀迅速置于液氮中冷凍1-3 h以上（凍存時間視組織量而定，保證樣品凍存充分），然后轉(zhuǎn)移至-80 °C長期保存。

4）將樣品管置于管架上固定好后埋在干冰箱的中間部位，大體積干冰運(yùn)輸

一次提取反應(yīng)所需細(xì)胞數(shù)≤1 X 10^7 ?個，以3 X 10^6-1 X 10^7 ?個為宜，可以將細(xì)胞經(jīng)裂解液裂解后凍存運(yùn)輸。

1、從培養(yǎng)箱中取出貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞，確定生長狀態(tài)良好（正常細(xì)胞融合度在80 %左右）;

2、棄去培養(yǎng)基，向細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中加入 5mL PBS（RNase free）， 清洗一次后棄盡PBS；

3、加入1mlPBS（RNase free）重懸后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中；

4、離心（依據(jù)客戶實驗室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速3000g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，置于液氮中速凍2h后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運(yùn)輸寄送。

離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，參考用量為每 5 X 10^6個細(xì)胞加 1 mL TRIzol；細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解，室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運(yùn)輸寄送。

液氮速凍法：

離心收集的細(xì)胞直接液氮速凍，速凍2h后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運(yùn)輸寄送。

一次提取反應(yīng)所需細(xì)胞數(shù)≤1 X 10^7 ?個，以3 X 10^6-1 X 10^7 ?個為宜，可以將細(xì)胞經(jīng)裂解液裂解后凍存運(yùn)輸。

1、確定細(xì)胞生長狀態(tài)良好；離心得到細(xì)胞沉淀（依據(jù)客戶實驗室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速3000g為宜）；

2、棄去培養(yǎng)基，加入 1 mlLPBS（RNase free，室溫），輕輕將細(xì)胞沉淀懸起， 轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 旋蓋尖底離心管（RNase free）中；

3、離心（依據(jù)客戶實驗室細(xì)胞離心步驟，注意細(xì)胞離心要適度，不要使細(xì)胞離心過實而造成裂解液不能充分滲透，4度離心機(jī)，轉(zhuǎn)速3000g為宜）得到細(xì)胞沉淀，棄去PBS，置于液氮中速凍2h后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運(yùn)輸寄送。

TRIzol 裂解法（僅限于RNA類產(chǎn)品）：

離心收集的細(xì)胞迅速溶于 TRIzol 裂解，參考用量為每 5 X 10^6個細(xì)胞加 1 mL TRIzol；細(xì)胞溶于 TRIzol 后，如出現(xiàn)成團(tuán)，需用吸頭將細(xì)胞團(tuán)吹打散，或者激烈震蕩混勻，使細(xì)胞完全溶于 TRIzol 中充分裂解，室溫靜置5min，之后轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運(yùn)輸寄送。

*注：判斷裂解液加入量是否合適的標(biāo)準(zhǔn)可以根據(jù)細(xì)胞溶解物的黏度來判斷。在細(xì)胞剛?cè)芙鈺r，可以發(fā)現(xiàn)有絲狀物出現(xiàn)，若裂解液加入量合適，吹打幾次后，絲狀物會消失，液體黏稠性下降；若裂解液的量過少，絲狀物往往一直存在，液體黏稠性大，應(yīng)繼續(xù)補(bǔ)加裂解液。裂解液加入量過少，會導(dǎo)致抽提的 RNA 降解。

收集的細(xì)胞直接液氮速凍后，轉(zhuǎn)移至-80℃低溫保存，送樣時選擇干冰運(yùn)輸寄送。

1、采血管選擇

采集血液進(jìn)行檢測面臨的一個主要問題就是細(xì)胞內(nèi) RNA 的不穩(wěn)定性，RNA 在采血后數(shù)小時內(nèi)便會迅速降解。此外，某些種屬的 RNA 在采血后會通過基因誘導(dǎo)在體外增加。體外RNA 降解和基因誘導(dǎo)均可導(dǎo)致體內(nèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目低估或高估。

BD 公司的 PAXgene 血液 RNA 管內(nèi)含能夠穩(wěn)定體內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄性狀的添加劑，它能夠減少體外 RNA 的降解，并將基因誘導(dǎo)的水平降低到最小程度，適用于人和靈長類動物全血樣品制備，對于全血樣品，我們只推薦使用此管送樣。

BD PAXgene 血液 RNA 管（貨號 762165）

2、采集血液

使用PAXgene血液RNA管前請仔細(xì)閱讀產(chǎn)品說明書，以便進(jìn)行正確的操作。如果PAXgene血液 RNA 管為唯一的抽血管，則將血液抽入 PAXgene 血液 RNA 管之前應(yīng)先抽血入“廢棄管”內(nèi)，使抽血過程中所用的采血器內(nèi)能被血液預(yù)灌注；否則 PAXgene 血液 RNA 管應(yīng)為抽血程序中的最后一只試管。確保血液已停止流入試管再從持針器上取下試管（PAXgene 血液 RNA管內(nèi)的負(fù)壓設(shè)計可向管內(nèi)抽 2.5ml 的血）。

采血后應(yīng)立即將 PAXgene 血液 RNA 管輕輕地顛倒 8-10 次，以確保管內(nèi)保護(hù)劑和血液充分混合均勻。

3、保存、運(yùn)輸

將 PAXgene 血液 RNA 管豎直置于室溫（18-25℃）靜置 2-24 小時，之后可貯藏于-20℃或更低溫度；若試管要貯藏于低于-20℃的溫度，先在-20℃冷凍 24 小時，然后再將其轉(zhuǎn)移到-70℃或-80℃，可保存至少 50 個月。大體積干冰運(yùn)輸。

2、上下輕輕顛倒混勻十次后，分裝到常規(guī)EP管中，轉(zhuǎn)移至-20或-80 °C長期保存（實際根據(jù)采血管的說明要求操作）

3、干冰運(yùn)輸

注：采集完血液之后需將血液轉(zhuǎn)移至EP管中，玻璃材質(zhì)采血管冷凍之后易碎

制備常見問題匯總

所有組織樣品務(wù)必根據(jù)質(zhì)量多少選擇使用下圖的螺紋管保存，嚴(yán)禁直接裝入密封袋或錫箔紙（低溫凍脆易破裂，導(dǎo)致樣品泄露，交叉污染）保存

組織送樣量要求

建議送樣量適用于95%的物種組織，少部分組織因胞內(nèi)核酸量較低，需適當(dāng)增加送樣量，比如植物果實、根等。送樣量過少或過多均不利于提取實驗，下限為建議量的一半，上限為建議量的3倍。隨著技術(shù)發(fā)展，當(dāng)前大部分產(chǎn)品建庫起始量較低，不需要太多組織，采樣量過多反而會造成速凍不徹底、提取取樣困難、凍融降解等危險。

1、RNA類產(chǎn)品建議組織送樣量

2、二代DNA類產(chǎn)品建議組織送樣量

3、三代DNA類產(chǎn)品建議組織送樣量

在腸道中，微生物與宿主之間進(jìn)行密切的信息交流，在代謝、免疫、神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控中起重要作用。不同組成的微生物能影響機(jī)體體重、消化功能、抵御感染和自身免疫疾病的患病風(fēng)險，此外，還能影響機(jī)體對藥物的反應(yīng)。這些腸道微生物主要通過小分子的代謝物與宿主進(jìn)行密切的相互作用。微生物的代謝組學(xué)可發(fā)現(xiàn)腸道微生物隨宿主病理生理變化的關(guān)鍵代謝物，為微生物組-宿主互作機(jī)制研究提供線索。通過微生物組+代謝組聯(lián)合分析，可以對微生物與代謝物之間的相互關(guān)系進(jìn)行研究，如微生物菌群與其生存環(huán)境的關(guān)系，代謝物對微生物穩(wěn)態(tài)的影響，菌群改變在復(fù)雜疾病中的作用機(jī)理，微生物菌群的生理作用與其代謝產(chǎn)物及其代謝功能之間的相互作用關(guān)系及微生物菌群參與的多種代謝調(diào)控途徑等。在宿主生理、疾病病理、藥物藥理等方面具有良好的應(yīng)用前景。

代謝組學(xué)+轉(zhuǎn)錄組學(xué)

代謝組是生物體發(fā)育和生理狀態(tài)在代謝水平的體現(xiàn)，是基因組與表型組之前的橋梁，差異積累的代謝物可以輔助時序表達(dá)的眾多基因進(jìn)行“共表達(dá)”分析，提示基因功能，研究分子生化機(jī)制，將基因與表型聯(lián)系起來。

轉(zhuǎn)錄組+代謝組的多組學(xué)分析，可以同時實現(xiàn)從“因”和“果”兩個層面來探究生物學(xué)問題，可以從大量轉(zhuǎn)錄本信息中快速鑒定代謝相關(guān)的功能基因，構(gòu)建核心調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，找出關(guān)鍵候選基因，闡述生物學(xué)現(xiàn)象。

代謝組學(xué)+蛋白質(zhì)組學(xué)

代謝組學(xué)目的是系統(tǒng)研究代謝中涉及的化學(xué)過程；蛋白質(zhì)作為酶可以調(diào)控生物體代謝過程，影響生物體內(nèi)代謝物濃度。通過整合分析。一方面可以結(jié)合兩個組學(xué)的分析結(jié)果，進(jìn)行相互驗證，提高后續(xù)實驗驗證成功率；另一方面也有助于相互補(bǔ)充，并且使研究更加系統(tǒng)。

實現(xiàn)對生物變化大趨勢與方向的綜合了解，提出分子生物學(xué)變化機(jī)制模型，并篩選出重點代謝通路相關(guān)的蛋白質(zhì)或者代謝產(chǎn)物，從而為后續(xù)進(jìn)行深入實驗與分析提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析文獻(xiàn)案例一

Integration analysis of metabolome and transcriptome profiles revealed the?age-dependent dynamic change in chicken meat.Food Research International (IF=6.475) 2022年6月代謝組和轉(zhuǎn)錄組的整合分析揭示不同生長發(fā)育時期雞的肉質(zhì)依賴性動態(tài)變化

研究方案

材料：選擇20頭泌乳中期奶牛，連續(xù)8周添加20 g m/d的RPM，

方法：宏基因組測序+非靶代謝組檢測

研究背景

雞胸肉含有不飽和脂肪酸和較低的脂肪、鈉和膽固醇，是大家最喜歡肉類之一。近年來，隨著人們對食品營養(yǎng)價值和自身健康的重視，研究者們開始致力于如何提高肉類質(zhì)量的研究，而生長時期是影響雞肉質(zhì)量的重要因素，但不同時期哪些特定代謝物積累是影響雞肉品質(zhì)的關(guān)鍵還不清楚。本研究使用代謝組和轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，確定了特定代謝物積累的關(guān)鍵基因，有助于了解肉類質(zhì)量發(fā)展下的生物過程，并探索特定代謝物積累的有價值的生物標(biāo)志物。

技術(shù)路線

 

主要研究結(jié)論

隨著日齡的增長，十五烷酸、硬脂酸、肌酸、肌肽、IMP、L-組氨酸和賴亮氨酸呈上升趨勢，而鵝氨酸、DHA、天冬氨酸、LPA 18:1和 LPI 18:1隨著日齡的增長而下降。

雞胸肉代謝受日齡影響的主要途徑是果糖和甘露糖代謝、花生四烯酸代謝、甾體激素生物合成、核黃素代謝、不飽和脂肪酸生物合成和亞油酸代謝。

代謝組和轉(zhuǎn)錄組的整合分析揭示了影響化學(xué)成分和代謝途徑的潛在功能基因，例如DGAT2、CYP2D6、APOV1、PLTP、PNMT。這些結(jié)果將有助于了解肉質(zhì)發(fā)展的生物學(xué)過程，并探索特定代謝物積累中有價值的生物標(biāo)志物。

多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析文獻(xiàn)案例案例二

Interaction Between the Intestinal Microbial Community and Transcriptome?Profile in Common Carp (Cyprinus carpio L.).Frontiers in microbiology(IF 6.064),2021年4月

微生物和轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析解析鯉魚腸道菌群與轉(zhuǎn)錄組水平的相互作用

研究方案

材料：黃河鯉新品系（中國水產(chǎn)科學(xué)院淡水漁業(yè)研究中心）和傳統(tǒng)黃河鯉，水池中單獨喂養(yǎng)。

方法：轉(zhuǎn)錄組＋16s微生物多樣性

研究背景

近年來，腸道微生物對宿主生產(chǎn)性能的影響受到廣泛關(guān)注。宿主的生產(chǎn)性能可以通過調(diào)節(jié)腸道微生物結(jié)構(gòu)來調(diào)節(jié)，而腸道微生物結(jié)構(gòu)又主要受遺傳和飼料的影響，腸道微生物也能影響宿主的基因表達(dá)和甲基化水平。研究發(fā)現(xiàn)約10%的宿主轉(zhuǎn)錄組受微生物調(diào)節(jié)，主要包括免疫、細(xì)胞增殖和代謝功能相關(guān)基因。腸道微生物與宿主基因表達(dá)之間的相互作用機(jī)制會影響飲食行為、消化過程、免疫功能和其他生理現(xiàn)象。一天中微生物的活動會改變宿主的生物節(jié)律、表觀遺傳學(xué)和代謝產(chǎn)物。當(dāng)微生物群落內(nèi)穩(wěn)態(tài)的節(jié)律被破壞時，宿主的正常染色質(zhì)和基因表達(dá)水平將發(fā)生變化，腸-肝軸基因表達(dá)的新機(jī)制將被激活，這種相互作用主要通過腦和肝的遠(yuǎn)程控制模式實現(xiàn)。因此，作者運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組和微生物多樣性聯(lián)合分析來解析新黃河鯉品種的腸道微生物群通過調(diào)節(jié)腸道基因表達(dá)影響其生長性能的方式，以此為黃河鯉新品種的選育提供參考。

技術(shù)路線

不同品種鯉魚腸道轉(zhuǎn)錄組與腸道微生物多樣性研究思路導(dǎo)圖

主要研究結(jié)果

腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與生長性能的關(guān)系：測量了黃河鯉新品四個生長性能參數(shù)（體重、長度、寬度和深度）。對照組的所有參數(shù)均比對照組顯著提高：重量14.58%，深度7.14%，寬度5.04%，長度5.07%。為了評估黃河鯉新品種的生長性能是否與其腸道菌群有關(guān)，將實驗組和對照組在相似的生長環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，并探討其腸道細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異。多樣性分析結(jié)果顯示實驗組的平均OTU豐富度（322.80±67.87）高于對照組（303.00±53.00）。實驗組和對照組共鑒定出94個共有的細(xì)菌類群。PCA 分析和系統(tǒng)發(fā)育樹將所有樣本分為兩部分，表明實驗組和對照組是可明顯區(qū)分的。在屬水平上對細(xì)菌組成（相對豐度）進(jìn)行分析，結(jié)果表明氣單胞菌（Aeromonas）是對照組的優(yōu)勢類群，其次是厚壁菌（Firmicutes）和玫瑰單胞菌（Roseomonas），而實驗組中，玫瑰單胞菌（Roseomonas）是優(yōu)勢類群，其次是厚壁菌（Firmicutes），然后是氣單胞菌（Aeromonas）。結(jié)果表明這兩個群體的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)是不同的，這意味著宿主（黃河鯉魚新品種）基因組與微生物組相互作用，以選擇某些微生物類群，暗示腸道菌群組成會影響鯉魚的生長性能。

實驗組和對照組之間的差異基因表達(dá)：使用與16S測序相同的樣本對黃河鯉新品種（實驗組）和對照組中的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序并鑒定差異基因（DEG）。在249個顯著DEGs中，194個基因表達(dá)下調(diào)，55個基因表達(dá)上調(diào)。通過GO注釋，這些基因被分為以下功能類別：生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞過程、解毒作用、發(fā)育過程、免疫系統(tǒng)進(jìn)程等（都屬于生物過程）；細(xì)胞、細(xì)胞部分、胞外區(qū)域、胞外區(qū)域部分、大分子復(fù)合物等（細(xì)胞成分）；抗氧化活性、結(jié)合活性、催化活性、分子功能調(diào)節(jié)器上等（分子功能）。聚類分析表明，實驗組和對照組具有不同的特征，DEG分為四個部分，大部分基因注釋到了免疫相關(guān)途徑。

與腸道細(xì)菌群落組成相關(guān)的差異表達(dá)基因：Pearson相關(guān)性用于推斷微生物屬級群落組成與DEGs之間的關(guān)系，共探索了2892對，包括245個基因和256個屬。篩選出來細(xì)菌群落具有屬級關(guān)系的前10個候選基因，其中許多參與免疫反應(yīng)，如H-2類組織相容性抗原、類 E-Sβ鏈（H2-Eb1）、類胸苷磷酸化酶（TYMP）、干擾素誘導(dǎo)蛋白44（IFI44）和主要組織相容性復(fù)合物I類相關(guān)基因蛋白樣（MR1）等。DNA修復(fù)蛋白RAD51同源物4（Rad51d）、ETS易位變異體5、轉(zhuǎn)錄本變異體X2（Etv5）和著絲粒蛋白Spc24（Spc24）與細(xì)胞分化和生長性能相關(guān)，這些基因可能在黃河鯉魚新品種生長性能中發(fā)揮關(guān)鍵作用?？偠灾c道細(xì)菌可以影響腸道中的基因表達(dá)，其中優(yōu)勢種或細(xì)菌結(jié)構(gòu)可能反映宿主黃鯉魚新品種的遺傳特征。腸道的細(xì)菌-基因表達(dá)譜有助于宿主腸道的健康和性能，通過與基因頻率配對確定前10個屬為：Bordetella,Lutispora,Methylocystis,Ohtaekwangia,Roseomonas,Shewanella,GpVI,Desulfovibrio,Candidatus_Berkiella and Azorhizobium，其中，Methylocystis數(shù)量最多，在甲烷循環(huán)中起作用。該研究提出了腸道細(xì)菌群落與基因表達(dá)相互作用的證據(jù)，共探索了2892對（屬級基因和細(xì)菌），包括245個基因256個屬。作者發(fā)現(xiàn)大多數(shù)基因涉及免疫學(xué)、細(xì)菌群落和細(xì)胞分化，其中大多數(shù)位于免疫相關(guān)信號通路中。該研究表明黃河鯉新品種生長性能的改善可能與其免疫反應(yīng)的改善及其在腸道細(xì)菌結(jié)構(gòu)中的相互作用有關(guān)。

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種質(zhì)資源是自然遺傳多樣性的重要來源，豐富的動植物種質(zhì)資源為遺傳資源和育種研究提供了基礎(chǔ)，但同時也給遺傳資源的保存、研究和利用帶來了困難。為此，F(xiàn)rankel等人于1984年提出了核心種質(zhì)（core?collection）的概念。構(gòu)建核心種質(zhì)資源庫是有效探索和保護(hù)遺傳資源新變異的重要途徑，近幾十年來，已經(jīng)在多種植物上建立了核心種質(zhì)資源庫，但是傳統(tǒng)的方法主要是通過形態(tài)學(xué)性狀和地理來源來判斷，這種方法存在明顯缺陷。隨著高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展，更有效的方法是基于基因型鑒定來篩選核心種質(zhì)，利用高分辨率的分子標(biāo)記類型，可以提高遺傳材料內(nèi)及材料間遺傳相似度和雜合度的鑒別能力，更加有利于核心種質(zhì)的構(gòu)建。

一、核心種質(zhì)資源庫概念：什么是核心種質(zhì)？

核心種質(zhì)資源（core?collection），即保存的種質(zhì)資源的一個核心子集，是采用一定方法，從保存的某一物種種質(zhì)資源中抽取的一個核心子集，以最少的遺傳資源樣本量最大限度地代表包括地理分布在內(nèi)的整個資源群體的遺傳多樣性，而未列入核心種質(zhì)的其它資源材料則作為保留樣本予以保存。因此核心種質(zhì)可以作為種質(zhì)資源群體研究和利用的切入點，從而提高整個種質(zhì)庫的管理和利用水平。

胡桃核心種質(zhì)篩選（Bernard et al., 2018）

二、核心種質(zhì)研究進(jìn)展

1984年，F(xiàn)rankel等人首次提出了核心種質(zhì)（core?collection）的概念。近幾十年來，核心種質(zhì)發(fā)展迅速，已在多種植物上建立核心種質(zhì)，特別是近幾年分子標(biāo)記和測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用使得基于高密度SNP標(biāo)記構(gòu)建核心種質(zhì)成為可能，對種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究也愈加深入。如（Girma?et?al.,?2020）等用879,407個SNP對2010份埃塞俄比亞高粱種質(zhì)資源進(jìn)行核心種質(zhì)資源鑒定，選擇了387個（種質(zhì)資源的20%）種質(zhì)作為核心種質(zhì)；（Kumar?et?al.,?2020）等用3,565,117個高質(zhì)量SNP對3004份水稻進(jìn)行核心種質(zhì)鑒定，得到一個包含520個種質(zhì)的微核心種質(zhì)，結(jié)果表明其代表了原有樣品的所有表型和地理來源；（Milner?et?al.,?2019）等對22,621份庫存大麥種質(zhì)資源基因組多樣性進(jìn)行研究，共選出1000份作為其核心種質(zhì)集。除此之外，還有芝麻、小麥、棉花、甘薯、葡萄、杏、黃瓜、茄子、杉木、馬尾松等多種植物成功構(gòu)建了核心種質(zhì)資源庫。

三、核心種質(zhì)研究技術(shù)路線

核心種質(zhì)研究技術(shù)路線

四、核心種質(zhì)材料選擇

種質(zhì)資源分為兩個層次，一是某個物種的所有種質(zhì)資源；另一是特定種質(zhì)資源。對于一個物種所有的種質(zhì)資源，應(yīng)盡可能選擇整個較多的該物種的材料；對于特定的種質(zhì)資源，可以選取不同地理位置性狀、表型性狀變異廣泛的材料、品種之間具有差異（野生種/馴化種/地方品種等）的材料。材料的選擇直接決定了核心種質(zhì)的表型和遺傳變異組成，因此，選擇用于篩選核心種質(zhì)的材料應(yīng)盡可能地保證種質(zhì)資源的遺傳多樣性。

五、核心種質(zhì)構(gòu)建方法

如前所述，核心種質(zhì)是要以最少的遺傳資源數(shù)量最大限度地代表包括地理分布在內(nèi)的整個資源群體的遺傳多樣性。所謂核心種質(zhì)構(gòu)建是指采用一定的方法從現(xiàn)有的種質(zhì)資源的總樣品中提取符合上述目標(biāo)的核心種質(zhì)。最初，包含形態(tài)和農(nóng)藝性狀的表型數(shù)據(jù)被用來創(chuàng)建核心集合，而現(xiàn)在分子標(biāo)記作為測量遺傳變異的中性工具已成為選擇的工具。核心種質(zhì)的構(gòu)建有不同的方法，（Lee?et?al.,?2020）利用PowerCore，根據(jù)從南瓜基因組中均勻分布的2071個SNP計算出的遺傳變異，從595個原始種質(zhì)中選出67個核心種質(zhì)；（Xu?et?al.,?2020）利用?Core?Hunter?II的Mstrat策略，從204個青藏高原青稞種質(zhì)中篩選得到41個核心種質(zhì)；（Liu?et?al.,?2020）利用LDSS方法對湖北省內(nèi)分布份208個重齒當(dāng)歸進(jìn)行核心種質(zhì)鑒定，發(fā)現(xiàn)包含42個種質(zhì)的核心種質(zhì)集能更好地代表原始種質(zhì)。從以上可以看出，不同的研究者在在不同物種核心種質(zhì)構(gòu)建過程中所采用的方法不盡一致，不管用哪種方法，前提都需要對整個種質(zhì)資源的群體結(jié)構(gòu)和多樣性組成有足夠的了解，根據(jù)遺傳變異標(biāo)記（SNP）數(shù)據(jù)，結(jié)合多種評估措施（Modified?Rogers?distance、Shannons?Diversity?Index等）進(jìn)行加權(quán)處理，篩選出具有高多樣性、高代表性和高等位基因豐富度的材料。

1234份黃瓜核心種質(zhì)鑒定（Wang et al., 2018）

204份青藏高原青稞核心種質(zhì)鑒定 （Xu et al., 2020）

六、核心種質(zhì)的評估

構(gòu)建好的核心種質(zhì)采用何種方法去評估核心樣品對整個種質(zhì)資源多樣性的代表性同樣是核心種質(zhì)研究中的重點。目前，大多數(shù)研究者結(jié)合不同的方法對核心種質(zhì)進(jìn)行評估驗證，通過對原始種質(zhì)材料和篩選的核心種質(zhì)材料進(jìn)行主成分分析，評估種質(zhì)篩選的準(zhǔn)確性，原則上，基于核心種質(zhì)繪制的主成分圖和所有材料的分布圖趨勢吻合，就能說明篩選結(jié)果的合理性；計算常規(guī)的遺傳多樣性指標(biāo)：觀測雜合度（Observed?heterozygosity）、期望雜合度（Expected?heterozygosity）、Nei遺傳多樣性（Nei?diversity?index）、香濃維納多樣性指數(shù)（Shanon-Wiener?index）、多態(tài)性信息含量（PIC），對原始種質(zhì)材料以及篩選的核心種質(zhì)的遺傳多樣性進(jìn)行評價；另外還包括等位基因評價和表型評價。

南瓜核心種質(zhì)PCA分析評估（Lee et al., 2020）

芋頭核心種質(zhì)遺傳多樣性評價估（Wang?et?al.,?2020）

七、總結(jié)

核心種質(zhì)可以最大限度地去除原始種質(zhì)資源中的重復(fù)，以最少的種質(zhì)材料代表原始種質(zhì)資源的全部或大多數(shù)遺傳多樣性和地理來源，為當(dāng)前越來越多的種質(zhì)資源收集、評價和利用帶來了便利，特別是隨著基因組學(xué)的發(fā)展，測序成本的極速下降，使得大規(guī)模群體測序得以實現(xiàn)。利用高分辨率的分子標(biāo)記，提升遺傳材料間遺傳相似度和雜合度的鑒別能力，從而選擇能夠代表整個種質(zhì)資源基因多樣性的大小合理的核心種質(zhì)材料，更加有助于種質(zhì)資源的保存、管理、使用。使得我們可以有重點地進(jìn)行優(yōu)異種質(zhì)的研究，結(jié)合GWAS分析、遺傳進(jìn)化分析、QTL定位、特有標(biāo)記開發(fā)等方法進(jìn)一步進(jìn)行基因的挖掘與克隆，提高種質(zhì)資源的利用效率。

八、案例分享

Genome-wide?assessment?of?population?structure?and?genetic?diversity?and?development?of?a?core?germplasm?set?for?sweet?potato?based?on?specific?length?amplified?fragment?(SLAF)?sequencing?[1]

研究材料：197份甘薯種質(zhì)資源（50個地方品種和147個栽培品種）

主要內(nèi)容：本研究利用SLAF-seq技術(shù)對甘薯的50個地方品種和147個栽培品種進(jìn)行簡化基因組測序，開發(fā)共得到了62,363個SNP標(biāo)記，基于這些SNP對本研究的197個甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性評估，群體結(jié)構(gòu)分析將材料分為三組；利用系統(tǒng)發(fā)育樹評估材料之間的遺傳關(guān)系，同樣將所有材料分為三個組。主成分分析?(PCA)?表明，這些種質(zhì)根據(jù)其種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分布。此外，計算了種質(zhì)間的平均遺傳距離、平均多態(tài)信息含量?(PIC)?和平均次要等位基因頻率?(MAF)?。使用?CoreHunter?軟件，鑒定得到了包含39?個材料的核心種質(zhì)，約占總種質(zhì)資源的19.8%。并對核心種質(zhì)從PCA分析、遺傳多樣性、等位基因數(shù)層面進(jìn)行了評價。本研究開發(fā)的甘薯核心種質(zhì)將為未來甘薯育種改良提供寶貴的種質(zhì)資源。

197份甘薯地理來源

馬尾松核心種質(zhì)

馬尾松GWAS分析

Core?set?construction?and?association?analysis?of?Pinus?massoniana?from?Guangdong?province?in?southern?China?using?SLAF-seq?[2]

研究材料：149份馬尾松種質(zhì)資源（來源于廣東省9個不同的地點）

主要內(nèi)容：在本研究中，采用SLAF-seq技術(shù)對從中國廣東收集的149份馬尾松（Pinus?massoniana）材料進(jìn)行測序，從599,164個多態(tài)性SLAF標(biāo)簽中鑒定了471,660個SNP標(biāo)記。群體結(jié)構(gòu)分析表明，149份馬尾松不能劃分成明顯的亞種群。使用遺傳距離和種群結(jié)構(gòu)來選擇核心種質(zhì)，篩選出包含29個材料的核心種質(zhì)，分別與樹脂產(chǎn)量和木材體積相關(guān)。對122份馬尾松材料進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，包括不同高度(HT)、胸徑(DBH)、樹脂質(zhì)量(RW)、木材體積(VW)和樹脂產(chǎn)率(RYC)，使用mrMLM、FASTmrMLM、FASTmrEMMA和ISIS?EM-BLASSO檢測到大量的SNP與性狀HT、DBH、RW和RYC顯著相關(guān)。馬尾松核心種質(zhì)為未來的改良育種提供寶貴的資源。

馬尾松核心種質(zhì)

馬尾松GWAS分析

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種質(zhì)資源是一切育種工作的基礎(chǔ)，是植物生命延續(xù)和種族繁衍的保證。我國種質(zhì)資源豐富多樣，目前，長期保存的種質(zhì)資源突破52萬份，位居全世界第二。但在種質(zhì)資源精準(zhǔn)鑒定和挖掘利用上還存在不足，構(gòu)建植物品種DNA指紋圖譜，可以克服單純依據(jù)形態(tài)特征鑒定品種的局限性，對于開展種質(zhì)資源精準(zhǔn)鑒定與基因發(fā)掘工作十分重要。

什么是DNA指紋圖譜？

DNA?指紋圖譜技術(shù)（DNA-Fingerprinting）是由英國科學(xué)家?Jeffreys?于?1986?年開發(fā)，具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點，是鑒別品種、品系的有力工具，已廣泛應(yīng)用于很多作物的品種資源多樣性和純度鑒定研究。相較于傳統(tǒng)的分子標(biāo)記，SNPs在基因組中更豐富，具有數(shù)量大、基因組分布廣、穩(wěn)定性和遺傳力高、鑒定簡單等優(yōu)點，可用于快速、高通量的基因分型分析。構(gòu)建基于SNP標(biāo)記技術(shù)的DNA指紋圖譜對于品種特異性和真實性鑒別、種子純度鑒定具有重要意義。

茶樹指紋圖譜

DNA指紋圖譜技術(shù)原理路線

DNA指紋圖譜的發(fā)展

DNA指紋圖譜具有豐富的多態(tài)性，具有高度的個體特異性和環(huán)境穩(wěn)定性，可以像人類指紋一樣用來區(qū)分不同的個體。早期的品種鑒定手段主要依賴于形態(tài)學(xué)鑒定，這種方法耗時較長且易受環(huán)境影響。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)為品種鑒定提供了新的手段。與形態(tài)標(biāo)記相比，基于DNA序列差異的分子標(biāo)記具有不易受環(huán)境影響、數(shù)量多、分布廣、多態(tài)性高、自然材料存在豐富的變異等特點，為育種材料的選擇和鑒定提供了極大的便利。

SNP與其他傳統(tǒng)標(biāo)記相比，其針對性更強(qiáng)、變異來源更豐富、潛在數(shù)量更巨大，越來越多的物種利用SNP分子標(biāo)記鑒定植物的指紋圖譜,?提高植物品種的資源管理與品種保護(hù)利用。如（Tian?et?al.,?2021）利用篩選到的200個核心SNP位點構(gòu)建了一個包含20,000個玉米材料的SNP-DNA指紋數(shù)據(jù)庫，為我國玉米在品種認(rèn)證、純度確定和品種權(quán)利保護(hù)方面發(fā)揮著重要作用；（Wang?et?al.,?2021）利用SNP標(biāo)記構(gòu)建了216個雪茄種質(zhì)資源的指紋圖譜，為優(yōu)質(zhì)雪茄種質(zhì)資源的篩選和鑒定、重要基因的挖掘提供了科學(xué)依據(jù)，為今后在分子水平上開展雪茄遺傳和育種工作奠定了基礎(chǔ)。此外，SNP?標(biāo)記也在大豆、油菜、香菇、茶樹、楊梅、西蘭花等品種的DNA指紋圖譜構(gòu)建中得到了應(yīng)用。

DNA指紋圖譜構(gòu)建及應(yīng)用

1.SNP標(biāo)記開發(fā)與篩選

目前常用的SNP檢測與分型的方法主要有全基因組重測序、簡化基因組重測序和基因芯片技術(shù)三種。通過這些方法開發(fā)的SNP經(jīng)過變異檢測、注釋和篩選后，得到質(zhì)量高、代表性強(qiáng)、標(biāo)記（組合）的材料區(qū)分度高、在基因組上分布均勻、特異性強(qiáng)的SNP標(biāo)記作為DNA指紋圖譜的候選標(biāo)記。

雪茄SNP分析

2.SNP標(biāo)記評估

遺傳多樣性（Genetic?diversity）指生物種內(nèi)基因的變化，包括種內(nèi)顯著不同的群體之間以及同一種群內(nèi)的遺傳變異。種群內(nèi)的個體之間往往沒有完全一致的基因型，而種群就是由這些不同遺傳結(jié)構(gòu)的多個個體組成。對遺傳多樣性的研究可以揭示物種或群體的進(jìn)化歷史（起源的時間、方式），也能為進(jìn)一步分析其進(jìn)化潛力和未來命運(yùn)提供重要資料，遺傳多樣性是保護(hù)生物學(xué)研究的核心之一。首先對篩選得到的SNP位點進(jìn)行遺傳多樣性評估，例如，在雪茄指紋圖譜構(gòu)建研究中，對篩選得到的715個SNP位點進(jìn)行遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)，這些位點表現(xiàn)出良好的多態(tài)性和品種鑒定能力，它們MAF和PIC值分別為0.346?~?0.500和0.350?~?0.375，平均值分別為0.45和0.37，其中，PIC值在0.370?~?0.375之間的占70.6%，表明這些標(biāo)記具有較強(qiáng)的多態(tài)性。715個可變SNP位點的雜合度范圍為0?~?0.64，平均為0.10，對該種質(zhì)資源的遺傳多樣性進(jìn)行了評價，發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性范圍從0.45到0.50不等，平均為0.49。結(jié)合MAF、PIC和觀察到的雜合度值，進(jìn)一步篩選分布在24條染色體上、無基因型數(shù)據(jù)缺失、以純合子變異位點為主，并在盡可能多的個體中檢測到的SNP位點，最終得到163個SNP位點。其次，對這些標(biāo)記位點通過系統(tǒng)發(fā)育樹、群體結(jié)構(gòu)、主成分分析進(jìn)行位點代表性的評估。

雪茄種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

3.DNA指紋圖譜構(gòu)建

篩選適宜的核心標(biāo)記位點，并將其用合適的形式展現(xiàn)出來至關(guān)重要。利用篩選得到的SNP標(biāo)記進(jìn)行品種材料的鑒定，并構(gòu)建DNA指紋圖譜。例如，玉米DNA指紋圖譜構(gòu)建研究中，利用384個?SNP?標(biāo)記組合構(gòu)建了?335?個玉米雜交種的基因型指紋圖譜,?該圖顯示每個品種的基因型組合均不同,?即?384?個?SNP?位點能夠有效區(qū)分所測試的雜交種。

335個玉米雜交種SNP-DNA指紋圖譜

并且還可以應(yīng)用構(gòu)建這些指紋圖譜的標(biāo)記信息的二維碼，其中包含品種名稱、類型、植物分類和基因型數(shù)據(jù)等信息，便于使用手機(jī)獲取信息。

某雪茄品種二維碼

寫在最后如同人類的指紋作為身份標(biāo)識一樣，植物的DNA指紋圖譜為其貼上了“分子身份證”，構(gòu)建植物品種DNA指紋圖譜，可以對品種資源管理和品種保護(hù)利用起到很好的作用。

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