日韩AV一区二区三区,色综合久久天天综合网 http://specchiomagico.net BioMarker Mon, 03 May 2032 15:33:46 +0000 zh-CN hourly 1 https://wordpress.org/?v=4.7.22 http://specchiomagico.net/wp-content/uploads/2020/04/cropped-512-512-32x32.png 微生物多樣性 – 百邁客生物 http://specchiomagico.net 32 32 微生物多樣性在水環(huán)境中的應(yīng)用：微生物多樣性測序結(jié)合qPCR揭示人糞便污染對水體影響 http://specchiomagico.net/archives/28647 Thu, 08 Dec 2022 07:31:35 +0000 http://specchiomagico.net/?p=28647 2022年9月30日，南開大學(xué)與山西醫(yī)科大學(xué)、常州大學(xué)合作在JCR Q1區(qū)《Journal of Hazardous Materials》（IF：14.224）發(fā)表題為“Unraveling the influence of human fecal pollution on antibiotic resistance gene levels in different receiving water bodies using crAssphage indicator gene ”的研究論文，該研究檢測了人類糞便和一系列受人類糞便影響的相關(guān)水體中抗生素耐藥基因(ARGs)、人類糞便污染指示基因crAssphage和抗生素的共存情況，結(jié)果表明，68.2%的研究水體中檢測到了crAssphage，證實(shí)了普遍存在的人類糞便環(huán)境污染。ARGs和crAssphage豐度都表現(xiàn)出從排放源（污水處理廠）到受納水體的距離衰減效應(yīng)。供試受納水體中ARG的豐度與人類糞便污染指示基因crAssphage豐度顯著相關(guān)，與抗生素殘留濃度不相關(guān)，證明了大量排放的人類糞便污染對受納水體ARGs的環(huán)境污染起到關(guān)鍵影響。該研究對明晰受人類糞便污染影響的水體中ARGs的污染特征和來源提供了重要見解。

發(fā)表期刊：Journal of Hazardous Materials IF：14.224

發(fā)表時間：2022.09.16

研究背景

環(huán)境中細(xì)菌的抗生素耐藥性由于與臨床病原體的抗生素耐藥性密切相關(guān)而受到越來越多的關(guān)注。自從人類在臨床上使用抗生素以來，環(huán)境中的抗生素耐藥基因(ARGs)亦有所增加。然而，這種增加是否直接來源于環(huán)境殘留抗生素的選擇性壓力還是來源于人類大量排放的糞便污染卻不得而知。在該項研究中，調(diào)查了人類糞便以及受人類糞便污染影響的不同污水處理廠受納水環(huán)境中的 ARGs、crAssphage 和抗生素殘留特征，以期了解抗生素的選擇壓力和人類糞便污染對受納水體ARGs污染的影響。

技術(shù)路線

主要結(jié)果

1.人類糞便和水環(huán)境中 ARGs 的污染特征

運(yùn)用高通量qPCR方法從采集的樣本中檢測到89個ARGs和5個MGEs。在所有檢的基因中，只有超廣譜β-內(nèi)酰胺酶編碼基因blaTEM在所有樣本中都被檢測到。在>80%的樣品中檢測到strB、ermF、aadA1等ARGs(圖1A)。在所有采集的人糞便中檢測到28種ARGs，包括tetW、 cfxA、 tetO-01、tet(32)、blaTEM-1等，而在所有水樣中僅檢測到strB和blaTEM-1(圖2)。此外，比較了不同的環(huán)境，發(fā)現(xiàn)在人類糞便和水中檢測到38個ARGs(圖3S1B)?？傮w而言，人糞便的ARG相對豐度顯著高于所有水樣。

圖1.不同樣品間ARG豐度和多樣性的比較。(A)ARG相對豐度熱圖。深藍(lán)(ND)表示結(jié)果低于檢測限；(B)ARG的總相對豐度；(C)ARG的香農(nóng)多樣性指數(shù)；(D)不同樣品中ARG組成的主坐標(biāo)分析(PCoA)。

ARG多樣性也隨著水從污水處理廠向自來水的輸送而減少(1C)。所有樣本的ARG譜的PCoA表明，不同類型的樣本包含顯著不同的ARG成分。從環(huán)境樣品中分離出人類糞便中的ARGs(圖1D)，表明腸道具有獨(dú)特的ARG圖譜。這可能是因?yàn)榕c環(huán)境相比，腸道的條件不同。來自污水處理廠和受納河水的樣品聚在一起較近，證實(shí)了污水處理廠出水的排放對受納河中的ARGs有很大影響。同樣，湖泊和自來水更傾向于聚集在一起，與所研究的湖泊都是自來水水源一致。上述結(jié)果表明，在所研究的樣品中普遍存在ARGs，污水處理廠攜帶的ARGs可能污染不同的受納水體。

2.人類糞便污染對水環(huán)境中 ARGs 的貢獻(xiàn)

借助人類糞便指示劑 crAssphage (CPQ_056)，分析了人類糞便排放對當(dāng)?shù)厮h(huán)境中ARGs的影響。結(jié)果表明，crAssphage在所有環(huán)境樣品中的檢測頻率為 68.2%，相對豐度范圍為2.68×10-6至1.96×10-2每個16S rRNA基因拷貝（圖2），表明超過一半的水樣（湖水、自來水、污水處理廠和受納河水）被人類糞便污染。與 ARGs 一致，平均crAssphage 豐度也沿著水流從污水處理廠不同處理單元的污水到受納河水再到湖泊水體的順序逐漸減少（圖2）。這再次證明了人類糞便污染從污水處理廠的排放源到接收環(huán)境有著隨距離不斷衰減的效應(yīng)。

進(jìn)一步的統(tǒng)計分析探討糞便污染對不同水體中 ARGs 的影響。Spearman相關(guān)性分析表明，總ARG相對豐度與crAssphage的豐度呈正相關(guān)（圖3A）。進(jìn)一步分析表明，crAssphage 豐度同樣與某些 ARG 的豐度顯著相關(guān)，例如氨基糖苷類、FCA、MLSB、其他/外排、四環(huán)素和磺胺抗性基因（圖3B-F，表S5）。14 種ARG亞型和ermF與 crAssphage 顯著相關(guān)。更重要的是，這些 ARGs 亞型也同時在人類和水環(huán)境中檢出，表明它們可能源自人類糞便并被輸送到受納水體。

此外，人類糞便樣本中ARGs豐度與 crAssphage豐度之間沒有相關(guān)性，證實(shí)了腸道里 ARGs 豐度與crAssphage 豐度無關(guān)。這對 crAssphage作為人類糞便污染的指示基因至關(guān)重要。因此，上述環(huán)境樣本中ARGs 與 crAssphage 豐度之間的顯著正相關(guān)表明供試受納水體中 ARGs 的富集在很大程度上可歸因于人類糞便污染。

除了crAssphage 之外，研究者通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析了來自所有樣品的氨芐青霉素抗性菌株中的 blaTEM-1基因序列（圖4）。結(jié)果表明，來自四種環(huán)境樣品（湖水、自來水、污水處理廠和受納河水）的blaTEM-1與腸道樣品的進(jìn)化關(guān)系密切（圖4）。該結(jié)果表明blaTEM-1可能通過污水排放在人類糞便和受納水體之間進(jìn)行傳播。然而，需要進(jìn)一步的研究來驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)。

圖2.不同類型樣品中crAssphage的分布

圖3.按目標(biāo)抗生素分類的ARGs總豐度與水樣中crAssphage豐度之間的相關(guān)性

圖4.從不同樣本分離的菌株中blaTEM-1基因的進(jìn)化分析。樣本根據(jù)類型進(jìn)行著色。

3.水環(huán)境中的 ARGs 豐度與抗生素殘留無關(guān)

研究者進(jìn)一步測量了抗生素殘留，結(jié)果表明，在所有五組中均檢測到四環(huán)素類、喹諾酮類和硝基呋喃類抗生素。污水處理廠樣品中17種抗生素的檢出頻率高于其他組，占 41.2%~64.7%。同時，在水環(huán)境中，污水處理廠的抗生素總濃度也高（289.5±236.7 ng/L），其次是受納河水（169.8±104.9 ng/L）。自來水在所有樣品中的抗生素殘留濃度低 (54.7 ± 51.0 ng/L)（表1）。人類糞便中的總抗生素濃度為 17.7±9.2 ng/g。由于糞便提供者在過去六個月內(nèi)都沒有用藥史，因此在人類糞便中檢測到的抗生素可能來自飲用水或食物。此外，在所研究的人類糞便中檢測到某些合成獸用抗生素，如磺胺氯噠嗪和恩諾沙星，也支持了這一結(jié)論。對水生環(huán)境中殘留的抗生素和 ARGs 進(jìn)行了相關(guān)性分析。與 crAssphage 不同，抗生素濃度與 ARG 豐度之間沒有相關(guān)性。這一結(jié)果表明抗生素的選擇并不能主要解釋供試水環(huán)境中 ARGs 的豐度。綜上所述，ARGs 和抗生素之間沒有相關(guān)性，但卻顯著相關(guān)于crAssphage豐度，表明供試受納水體中 ARGs 的豐度在很大程度上可以用人類糞便污染的程度來解釋，本研究并沒有觀察到明顯的抗生素選擇ARGs現(xiàn)象。

表1.不同樣品類型中的抗生素濃度(ND：低于檢測限值)。

4.細(xì)菌群落特征及其與ARGs的相關(guān)性

在人類糞便中，厚壁菌門、擬桿菌門、變形桿菌門和放線菌門是優(yōu)勢門(圖5A)。厚壁菌和擬桿菌占腸道菌群總數(shù)的(83.5±9.8)%，環(huán)境樣品中以變形桿菌和擬桿菌為主，變形桿菌所占比例高。在屬的水平上，人類的腸道Bacteroides，F(xiàn)aecalibacterium，Bifidobacterium， 和Subdoligranulum.Pseudomonas，而水環(huán)境中的優(yōu)勢屬為Flavobacterium，Arcobacter和Massilia(圖5B)。

細(xì)菌群落多樣性分析表明，除自來水外，其他水環(huán)境樣品的平均Shannon指數(shù)均高于人類糞便樣品(圖5C)。PCoA分析表明，人類糞便和環(huán)境樣本之間的細(xì)菌群落組成有顯著差異(圖5D)。然而，在人類糞便和水環(huán)境中存在著167個OTUS屬121個常見細(xì)菌屬，此外，還發(fā)現(xiàn)ARGs與所有樣品中的細(xì)菌群落顯著相關(guān)(圖3A)，這表明細(xì)菌群落組成決定了ARG組成，這一現(xiàn)象在各種環(huán)境中都被廣泛觀察到。

圖5.不同樣品中細(xì)菌群落的比較。(A)top10優(yōu)勢菌門的相對豐度；(B)top10優(yōu)勢菌屬的相對豐度；(C)OTUs的Shannon指數(shù)；(D)OTUs的主坐標(biāo)分析(PCoA)。

在該研究中，84個ARGs、5個MGES和20個細(xì)菌門被用來進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析(圖6B)。Chlamydiae和Dependentiae 與11種不同的ARG顯著相關(guān)，表明它們的基因組中可能含有多種ARG類型。四環(huán)素耐藥基因、大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因ermB和氨基糖苷類耐藥基因aacA/aphD是四環(huán)素耐藥基因的潛在宿主。Elusimmicrobia可能是aadE、blaCTX-M-02、Olec和vanRA-01的宿主。Synergistetes 可能是tetW、IS613和catA1的潛在宿主。由于該網(wǎng)絡(luò)是建立在相關(guān)性的基礎(chǔ)上，觀察到的ARGs潛在細(xì)菌宿主仍需進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

圖6.不同樣品中細(xì)菌群落與ARGs的相關(guān)性。(1)ARGs和細(xì)菌群落的Procrstes分析(2)細(xì)菌門和ARGs之間的網(wǎng)絡(luò)分析

總結(jié)

這項研究主要表明，人類排泄物對受污水處理廠影響的受納水體中的ARGs有顯著的影響。ARG和crAssphage豐度都表現(xiàn)出從排放源到受納水體的距離衰減效應(yīng)。人類糞便中的blaTEM-1基因與水環(huán)境中的blaTEM-1基因具有密切的進(jìn)化關(guān)系。在被人類糞便污染的環(huán)境中，糞便污染可能是ARG污染的主要來源?？股貧埩魸舛扰cARGs豐度之間無顯著的相關(guān)性，表明環(huán)境殘留抗生素選擇產(chǎn)生ARGs的現(xiàn)象并不明顯。該研究促進(jìn)了公眾對人類影響環(huán)境中人類糞便污染對抗生素耐藥性的影響的理解。

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參考文獻(xiàn)

Chen Z， Duan Y， Yin L， et al. Unraveling the influence of human fecal pollution on antibiotic resistance gene levels in different receiving water bodies using crAssphage indicator gene[J]. Journal of Hazardous Materials， 2023， 442: 130005.

]]> [成功案例]-中醫(yī)藥之微生物多樣性-咖啡酸調(diào)節(jié)小鼠腸道微生物群預(yù)防高脂肪飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝 http://specchiomagico.net/archives/21836 Tue, 31 Aug 2021 06:10:57 +0000 http://specchiomagico.net/?p=21836 近日，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究所在Food Research International （IF=5.0）雜志發(fā)表了Caffeic acid prevents non-alcoholic fatty liver disease induced by a high-fat diet through gut microbiota modulation in mice一文，探討了咖啡酸在小鼠腸道中對微生物菌群的影響，從而為非酒精性脂肪性肝病的預(yù)防提出新的見解理論基礎(chǔ)。其中微生物多樣性檢測由百邁客協(xié)助完成。

研究背景

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成為全世界關(guān)注的主要健康問題;它是一種主要的隱性疾病，會增加罹患多種慢性疾病的風(fēng)險，如2型糖尿病和心血管疾病。NAFLD患者有發(fā)展為脂肪肝、肝硬化甚至肝細(xì)胞癌的風(fēng)險。然而，NAFLD的誘導(dǎo)和進(jìn)展的病理機(jī)制復(fù)雜，目前還沒有明確的靶向藥物。改變生活方式和改變飲食是目前緩解NAFLD的主要策略。因此，確定NAFLD的新靶點(diǎn)和治療方法仍然是一個挑戰(zhàn)。

NAFLD是由肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度堆積引起的，新生脂肪生成是脂肪儲存的重要途徑。肝臟脂肪生成主要由固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白1 (Srebp1)調(diào)控，Srebp1增強(qiáng)脂肪生成基因的后續(xù)激活，包括脂肪酸合成酶(Fas)、乙酰輔酶a羧化酶(Acc)和硬脂酰輔酶a去飽和酶1 (Scd1)，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)積累。此外，NAFLD的發(fā)病和進(jìn)展是眾所周知的與炎癥有關(guān)。腸道衍生毒素，如脂多糖(LPS)，被認(rèn)為在肝臟炎癥中具有致病作用，并與NAFLD密切相關(guān)。一方面，有報道稱LPS可促進(jìn)Srebpl激活和肝臟脂質(zhì)積聚。相反，LPS通過激活肝臟toll樣受體4 (TLR4)/核因子-κB (NF-kB)信號通路觸發(fā)炎癥反應(yīng)。

近年來，腸道菌群與NAFLD的關(guān)系引起了廣泛關(guān)注。腸道微生物群產(chǎn)生促炎LPS并進(jìn)一步影響肝臟脂質(zhì)代謝，已成為NAFLD發(fā)展的重要參與者。研究表明，高脂肪飲食(HFD)喂養(yǎng)的無菌小鼠肝臟中的脂質(zhì)水平低于傳統(tǒng)飼養(yǎng)的小鼠。此外，將從高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖供體中分離出的腸道微生物移植到無菌動物中，會導(dǎo)致受體小鼠體重顯著增加和代謝綜合征。因此，腸道菌群的穩(wěn)態(tài)對維持健康至關(guān)重要，確定腸道菌群的組成對于研究NAFLD與失調(diào)之間的致病關(guān)系和潛在致病聯(lián)系是必要的。

咖啡酸(CA)，也被稱為3,4 -二羥基肉桂酸，是最常見的酚酸之一，存在于大多數(shù)植物中，包括咖啡、水果和丹參。CA在人類飲食中廣泛使用。越來越多的證據(jù)證實(shí)CA具有多種生物功能，包括抗氧化和抗炎活性。與此同時,據(jù)報道,CA減少alcohol-fed老鼠的肝臟脂質(zhì)含量,抑制油的段脂肪生成人類HepG2細(xì)胞,和改善小鼠的肝脂肪變性和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過增加自噬。然而，CA作用于脂質(zhì)積累的機(jī)制尚不清楚。枸杞葉提取物含有多種酚酸，包括CA，有研究表明，枸杞葉提取物可以通過調(diào)節(jié)代謝譜和腸道菌群組成來改善大鼠2型糖尿病。然而，目前尚無關(guān)于CA對NAFLD腸道菌群影響的研究報道。本研究旨在探討CA對NAFLD的降脂作用及其機(jī)制，尤其關(guān)注其對腸道菌群的影響。

英文名稱: Caffeic acid prevents non-alcoholic fatty liver disease induced by a high-fat

diet through gut microbiota modulation in mice

中文名稱:?咖啡酸通過調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群預(yù)防由高脂肪飲食引起的非酒精性脂肪肝

雜??志：Food Research International

影響因子：5.0

材料方法

1、實(shí)驗(yàn)材料：
6周齡雄性C57BL/6J小鼠，正常鼠糧(ND, 1025)、ND添加0.08%或0.16% CA 、HFD(合成飼糧添加0.15%膽固醇，w/w, H10141)，HFD添加0.08%或0.16% 。
2、研究方法：

在ND適應(yīng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為2組:ND組(n = 30)和HFD組(n = 30)，治療8周。

ND組小鼠隨機(jī)分為3組(n = 10)，飼喂特定飼料，為期8周。這些組包括:1)喂食正常食物的ND小鼠;2)低ND+CA，喂食CA含量為0.08%的正常鼠糧;3)高ND+CA，喂食CA含量為0.16%的正常飼料。同時，高脂飲食組按以下飼料隨機(jī)分為3組(n = 10)，飼養(yǎng)期8周。這些組包括1)高脂飲食小鼠;2) HFD+CA-low組，高脂日糧中添加0.08% CA;3) HFD+CA高組，飼喂添加0.16% CA的高脂飼糧，每2周測量體重。
最后用戊巴比妥(30 mg/kg)麻醉小鼠。小鼠經(jīng)心臟穿刺采血后處死，取肝臟稱重?；啬c、盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物無菌收集，立即置于- 80°C保存至使用。

研究結(jié)果

1.補(bǔ)充CA可降低高脂喂養(yǎng)小鼠的脂質(zhì)積累

? ? ? ?本研究旨在評估CA治療高脂喂養(yǎng)小鼠的潛在益處，重點(diǎn)關(guān)注在NAFLD發(fā)病機(jī)制中，除了調(diào)節(jié)內(nèi)毒素相關(guān)炎癥信號機(jī)制和脂代謝改變外，恢復(fù)腸道菌群平衡可能與之有關(guān)。為了研究CA對脂質(zhì)積累的影響，我們分別用低濃度和高濃度的CA喂養(yǎng)小鼠。肝脂肪變性是主要的組織病理學(xué)表現(xiàn);在其他研究中觀察到，高脂飼料喂養(yǎng)小鼠的肝臟比三組ND小鼠的肝臟出現(xiàn)更多的脂肪變性，宏觀上黃色和堅硬的紋理證明了這一點(diǎn)(圖1A)。值得注意的是，添加0.08%或0.16% CA的HFD小鼠肝臟表面呈紅褐色，質(zhì)地柔軟。肝切片HE染色(圖1B)和油紅O染色(圖1C)證實(shí)了這一點(diǎn)。與ND組相比，高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠脂肪滴更多、更大，而CA處理的小鼠脂肪滴更少。與ND組相比，HFD干預(yù)8周后小鼠體重顯著增加，并持續(xù)增加至16周。然而，從第8周開始，飼糧中添加0.08%或0.16%的CA可以有效地緩解hfd誘導(dǎo)的體重增加，特別是在第14周(CA濃度均為)和第16周(僅添加0.08% CA)時(圖1D)。在肝臟重量(圖1E)、體重(圖1F)和肝臟/體重(圖1G)以及兩種濃度的CA處理中也可以觀察到類似的結(jié)果，這降低了hfd誘導(dǎo)的肝臟重量、體重和肝臟/體重的增加。與只喂食ND組相比，添加CA的ND組對這些指標(biāo)沒有任何差異。
圖1

2.CA的補(bǔ)充影響hfd喂養(yǎng)小鼠的生化標(biāo)記物

? ? ? ? ?血清TC、TG、HDL-C和LDL-C升高是HFD組小鼠的主要特征。同樣，HFD組小鼠血清TC、HDL- C、LDL-C水平明顯升高，提示小鼠出現(xiàn)高脂血癥。CA處理在低和血清TC、TG、HDL-C和LDL-C升高是HFD組小鼠的主要特征。同樣，HFD組小鼠血清TC、HDL- C、LDL-C水平明顯升高，提示小鼠出現(xiàn)高脂血癥。CA處理在低和低濃度的TC、HDL-C和LDL-C對hfd誘導(dǎo)的血清高脂血癥有緩解作用。但各組間血清TG水平無顯著差異(圖2A-D)。在HFD組中，ALT、AST、葡萄糖和hsCRP水平均升高，而在喂食HFD的小鼠中，添加兩種濃度的CA只恢復(fù)了血清中ALT和葡萄糖(圖2E-H)。添加CA的ND小鼠與只添加ND的小鼠表現(xiàn)出幾乎相同的結(jié)果。
? ? ?圖2
3.補(bǔ)充CA可調(diào)節(jié)高脂喂養(yǎng)小鼠脂肪生成相關(guān)蛋白表達(dá)
Srebp1是大多數(shù)肝脂合成基因的主調(diào)控基因，包括Fas、Acc和Scd1。Fas為TG提供非酯化脂肪酸底物，導(dǎo)致脂肪酸合成和TG積累增強(qiáng)。Acc將乙酰輔酶a轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶a，參與脂肪酸合成。Scd1有助于脂肪酸去飽和。Srebp1及其靶基因Fas、Acc和Scd1在NAFLD中上調(diào)，抑制Srebp1活性可抑制Fas、Acc、Scd1和TG的積累。接下來，我們評估了CA對高脂喂養(yǎng)小鼠新生脂肪形成相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。我們的結(jié)果表明，與對照組相比，HFD顯著上調(diào)了肝組織中Srebp1、Fas、Acc和Scd1的表達(dá)，而低濃度和高濃度CA的補(bǔ)充均不同程度地減弱了該表達(dá)。添加CA的ND小鼠與只給ND小鼠沒有明顯差異(圖3A-E)

?圖 3
4.補(bǔ)充CA可減輕高脂喂養(yǎng)小鼠的內(nèi)毒素血癥和隨后的促炎反應(yīng)? ? ? ? ?
有報道稱，NAFLD的特征是腸道菌群改變、炎癥和腸道屏障破壞。肝組織炎癥被認(rèn)為是肝脂肪變性發(fā)展的驅(qū)動因素，腸道源性脂多糖被認(rèn)為在肝臟炎癥中具有致病作用。最近的動物實(shí)驗(yàn)研究關(guān)注了腸道菌群LPS在NAFLD發(fā)生中的作用。腸道源性LPS是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分，通過TLR4信號通路和下游炎癥級聯(lián)反應(yīng)促進(jìn)炎癥反應(yīng)。有報道稱，在NAFLD模型中，與野生型小鼠相比，tlr4缺陷小鼠的肝損傷、炎癥和脂質(zhì)積累減少。此外，阻斷腸道菌群與宿主細(xì)胞之間的脂多糖- tlr4相互作用可以阻止高脂喂養(yǎng)小鼠NAFLD的啟動和發(fā)展，這證實(shí)了脂多糖- tlr4通路在誘導(dǎo)NAFLD中具有非常重要的作用。與之前的研究結(jié)果一致，我們的研究表明，16周高脂飲食導(dǎo)致血清LPS和肝臟TLR4表達(dá)顯著增加，肝組織中磷酸化的NF-kB p65被激活，表明炎癥開始。同時，高脂喂養(yǎng)小鼠血清TNF-a、IL-6水平升高，肝臟mpo陽性細(xì)胞浸潤。所有劑量的CA補(bǔ)充均顯著扭轉(zhuǎn)了上述現(xiàn)象;在添加ca的ND組中沒有觀察到顯著差異(圖4A-G)。

圖4

5.補(bǔ)充CA可減少高脂飼料喂養(yǎng)小鼠的腸道菌群失調(diào)

? ? ? ? 越來越多的證據(jù)表明，腸道微生物群是NAFLD發(fā)展和進(jìn)展中的一種新的生物標(biāo)志物，它通過涉及炎癥反應(yīng)激活和代謝調(diào)節(jié)的機(jī)制促進(jìn)其發(fā)展。腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致NAFLD的可能機(jī)制可歸納為:干擾能量收獲和支出之間的平衡,促進(jìn)肝臟炎癥(損害腸道完整性、促進(jìn)內(nèi)毒素和啟動與細(xì)胞因子釋放炎癥級聯(lián)),并改變生物化學(xué)代謝和腸道m(xù)icrobiota-related代謝物(如膽汁酸,短鏈脂肪酸,芳香族氨基酸衍生品,支鏈氨基酸,等等)。因此，調(diào)節(jié)腸道菌群組成及其代謝功能具有抑制NAFLD發(fā)展的潛力。此前的研究表明，多酚具有類似益生元的作用，能夠改變腸道微生物平衡，改善腸道黏膜炎癥和通透性。因此，我們分析了不同區(qū)域的腸道菌群組成研究結(jié)果表明，CA可能參與調(diào)節(jié)腸道細(xì)菌組成。
? ? ? ? 研究了6組中回腸、盲腸、結(jié)腸3個腸段內(nèi)容物中腸道菌群組成的變化。如圖5A所示，與ND組相比，HFD小鼠回腸腸道菌群中觀察到的OTUs明顯降低，同時盲腸和結(jié)腸的OTUs也有下降趨勢。添加0.16% CA的HFD組小鼠回腸和結(jié)腸OTUs顯著增加。有趣的是，在添加0.08% CA的ND組中，除了結(jié)腸OTUs的減少外，添加CA可導(dǎo)致正常飼糧小鼠OTUs的減少。進(jìn)行Alpha多樣性分析，包括ACE(圖5B)、Chao1(圖5C)、Shannon(圖5D)和Simpson指數(shù)(圖5E)。ACE、Chao1、Shannon和Simpson的變化與OTUs的變化平行，表明HFD破壞了腸道菌群的豐富度和多樣性。同時，添加CA可在一定程度上恢復(fù)植物區(qū)系的豐富度和多樣性，尤其是在HFD中添加0.16% CA時。在ND組中添加CA導(dǎo)致了微生物群落豐富度和多樣性的降低，表明其作用可能與HFD組不同。此外，已知多酚可以下調(diào)微生物多樣性，顯著抑制致病菌的生長;因此，添加CA的ND組細(xì)菌OTU、豐富度和多樣性的降低可能與CA的抑菌作用有關(guān)。利用Beta多樣性分析分析腸道菌群整體結(jié)構(gòu)的變化。主成分分析顯示不同的微生物群組成和單獨(dú)的集群之間HFD老鼠和ND老鼠,和HFD老鼠和HFD之間補(bǔ)充高濃度的CA。然而,HFD小鼠的腸道微生物群補(bǔ)充CA濃度較低的不是明顯不同于回腸HFD老鼠,盲腸和結(jié)腸。此外，ND處理組間的微生物菌群組成沒有差異(圖5F、G和H)。PCA識別出回腸、盲腸和結(jié)腸中兩個最易變的菌群——Allobaculum和Faecalibaculum，這意味著它們導(dǎo)致了組間觀察到的差異。PCA結(jié)果顯示，PC1(48.59%)具有a盲腸總方差高于PC2(21.36%)，說明CA處理可使hfd誘導(dǎo)的腸道菌群組成與ND組相似。通過beta多樣性分析，我們發(fā)現(xiàn)CA處理組(特別是添加0.16% CA)和HFD處理組具有不同的菌群組成，提示CA對腸道菌群的修飾作用。
圖5
6.腸道菌群與NAFLD相關(guān)參數(shù)的相關(guān)性

? ? ? ? CA對hfd誘導(dǎo)小鼠腸道菌群組成、體增重、內(nèi)臟肥胖、血脂水平、炎癥等有保護(hù)作用。我們進(jìn)一步采用Spearman秩相關(guān)法對上述過濾后的糞便細(xì)菌與NAFLD相關(guān)參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。我們觀察到肝臟重量、體重、肝臟/體重、血清TC、HDL-C、LDL-C、LPS、TNF-a和IL- 6水平與Allobacul^n、Barne- siella、Faecalibacterium和uncultured_bact:erium_f_Muribaculaceae的相對豐度(屬水平)呈顯著負(fù)相關(guān)。此外,相對豐度(在屬級)的彎曲桿菌,Faecalibaculum,梭菌屬,Lachnospiraceae_XPB1014_group和uncultured_bacterium__p – 251 o5呈正相關(guān),與上面的非酒精性脂肪肝相關(guān)參數(shù),其中彎曲桿菌,Lach nospiraceae_XPB1014_group和uncultured_bacterium__p – 251 o5顯示最重要的正相關(guān)與非酒精性脂肪肝相關(guān)參數(shù)(圖6)。與這一結(jié)果一致,Allobaculum, Barnesiella,與ND組相比，高脂喂養(yǎng)小鼠的糞桿菌和未培養(yǎng)的細(xì)菌^Muribaculaceae減少。同時，HFD組Campylobacter、Faecalibaculum、Fusobacterium、Lachno- spiraceae_XPB1014_group和uncultured_bact:erium_f_p-251-o5的相對豐度增加，CA處理顯著降低了上述腸道菌群的相對豐度。
? ? ? ? ?
圖6
以上結(jié)果表明，HFD組的脂多糖抑制屬明顯減少。同時，HFD組的脂多糖產(chǎn)生屬增加，ca處理HFD組的脂多糖產(chǎn)生屬減少。例如，Allobaculum, Barnesiella和Faecalibacterium被報道為短鏈脂肪酸產(chǎn)生菌。短鏈脂肪酸可能刺激上皮細(xì)胞增殖，并在改善腸道屏障完整性方面發(fā)揮重要作用，可能抑制LPS釋放和抗肥胖活性。彎曲桿菌是一種影響宿主健康的機(jī)會致病菌。大腸桿菌志賀氏菌(escherichia -志賀氏菌)是一種革蘭氏陰性菌，其細(xì)胞壁中含有LPS，在HFD組中顯著增加。眾所周知，當(dāng)腸道屏障受損時，革蘭氏陰性菌釋放LPS到血液中，它們與小腸細(xì)菌過度生長密切相關(guān)。糞鈣桿菌(Faecalibaculum)和梭桿菌(Fusobacterium)均為促炎菌，可能破壞腸道屏障，并與惡化的肝臟脂肪變性有關(guān)。它們也可能有助于NAFLD患者血清LPS和TNF-a的高表達(dá)。因此，我們得出結(jié)論，CA有助于平衡腸道脂多糖相關(guān)菌群失調(diào)，并有助于預(yù)防NAFLD中低級別慢性炎癥。
在這項研究中,我們表明,補(bǔ)充低和高濃度的CA HFD不僅減少HFD-induced肥胖、改善血清脂質(zhì),ALT, AST,葡萄糖,hsCRP,有限合伙人,TNF-a和il – 6和鈍化脂肪生成,而且還改變了在非酒精性脂肪肝小鼠腸道微生物群組成,表明CA除了可以作為新策略來抑制非酒精性脂肪肝的發(fā)展。在大多數(shù)情況下，HFD中添加0.16% CA比低濃度CA更能有效地降低NAFLD相關(guān)參數(shù)。這些結(jié)果提示，腸道微生物群可能參與了CA對脂質(zhì)代謝和NAFLD的影響。

7.結(jié)論

? ? ? ? 本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠NAFLD模型，首次證實(shí)了CA對NAFLD小鼠腸道菌群的影響。我們報道CA顯著改變了腸道微生物的群落組成結(jié)構(gòu)，并降低了NAFLD參數(shù)。此外，我們還發(fā)現(xiàn)一些微生物群的相對豐度與NAFLD參數(shù)密切相關(guān)。我們的研究結(jié)果表明，CA通過抑制腸道失調(diào)、促炎癥LPS釋放和隨后的脂質(zhì)合成等綜合反應(yīng)，對高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD發(fā)展發(fā)揮保護(hù)作用。
文獻(xiàn)下載：https://international.biocloud.net/zh/article/detail/33992352
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英文標(biāo)題：Extract of the Microalga Nitzschia laevis Prevents High‐Fat‐Diet Induced Obesity in Mice by Modulating the Composition of Gut Microbiota
中文標(biāo)題：菱形藻（Nitzschia laevis）通過調(diào)節(jié)腸道菌群來緩解高脂膳食引起的肥胖
發(fā)表時間：2018.12
期刊名稱：Molecular nutrition & food research
影響因子：5.15
合作單位：北京大學(xué)?食品與生物資源工程研究所

研究背景

隨著人類生活水平的提高，肥胖和超重人口越來越多，而人工合成藥物（如褪黑素）的肥胖治療往往會產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)，因此，從自然界中提取成分“溫和”的生物合成藥物已經(jīng)被人們廣泛關(guān)注，近年來，以微藻為代表的海洋生物已成為研究的熱點(diǎn)。研究表明，藻類中提取的輔助色素巖藻黃素能夠通過抑制解偶聯(lián)蛋白1（UCP1）調(diào)節(jié)脂肪組織的脂質(zhì)代謝，巖藻黃素是一種四十二碳葉黃素，目前已被開發(fā)作為有效的減肥藥。菱形藻（Nitzschia laevis）是一種富含巖藻黃素的硅藻，也是多酚和多不飽和脂肪酸（PUFAs）的主要來源，多酚和PUFAs能夠調(diào)節(jié)腸道微生物的菌群結(jié)構(gòu)和活性。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖患者和正常人群的腸道微生物存在差異，因此推測，菱形藻中的提取物能夠通過調(diào)節(jié)腸道微生物實(shí)現(xiàn)控制和治療肥胖的效果。

材料方法

1. 菱形藻的制備和培養(yǎng)：藻種為Nitzschia laevis (UTEX2047)，采用HPLC-DAD、GC-MS和LC-MS分離檢測色素、多酚和多不飽和脂肪酸（PUFAs）。

2. 試驗(yàn)對象：10周齡C57BL/6J小鼠。

3.?分組方式：①正常膳食組（NCD）、②高脂膳食組（HFD）、③高脂+低藻（10 mg/kg/d）膳食組（HFD-LE）、④高脂+高藻（50 mg/kg/d）膳食組（HFD-HE）。

4. 組織學(xué)分析（H&E）：肩胛間的棕色脂肪組織（BAT）、白色脂肪組織（WAT）、附睪脂肪組織（epi-WAT）、腸系膜脂肪、腹溝股脂肪和腹膜后脂肪。

5. 生化分析：提取血清樣本，檢測總膽固醇（CHO）、總?cè)８视停═G）、低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）。

6. 蛋白印記分析（WB）:緊密連接蛋白（ZO-1）、閉合蛋白。

7. 實(shí)時熒光定量PCR（RT-PCR）：緊密連接蛋白（ZO-1）、閉合蛋白合成相關(guān)基因。

8. 腸道微生物多樣性：糞便樣本，16S rDNA V3-V4，Illumina Hiseq 2500，RDP數(shù)據(jù)庫，PICRUST預(yù)測功能基因（KEGG、COG）。

重要結(jié)果與討論

1. 菱形藻（Nitzschia laevis）對小鼠體重、脂肪厚度和肝脂肪的影響

水溶性化合物、類胡蘿卜素、多酚和脂肪酸的比例分別為13.55%、7.27%、13.83%和7.3%，多不飽和脂肪酸（PUFA）占總脂肪酸的30.32%。NLE對HFD導(dǎo)致的小鼠體重增加的抑制具有劑量依賴性（圖1B），NLE對HFD導(dǎo)致的小鼠體重增加的抑制作用不是通過抑制食物或能量攝入來實(shí)現(xiàn)的（圖1C;?1D）。NLE能夠降低HFD導(dǎo)致的脂肪厚度的增加（圖1E-1G）。

圖1. A-D：小鼠的體重相關(guān)特征；E-G：NLE對小鼠的白色脂肪組織的影響

2.?菱形藻（Nitzschia laevis）對小鼠肝臟的病理影響

NLE未能顯著降低HFD導(dǎo)致的BAT增長（圖2A），與脂肪代謝有關(guān)的UCP1和PGC1基因表達(dá)在HFD-LE組中顯著升高（圖2C-2D），HFD-HE顯著降低了肝重（圖2E），NLE對HFD誘導(dǎo)的脂肪增生具有有效的抑制作用（圖2F-2G）。Srebp1c與肝脂肪的變性有關(guān)，NLE對HFD導(dǎo)致的Srebp1c基因表達(dá)水平降低有恢復(fù)作用（圖2H）。

圖2. A-D：NLE對小鼠的棕色脂肪組織的影響；E-H：NLE對小鼠肝臟脂肪變性的影響

3. 菱形藻（Nitzschia laevis）對小鼠血脂、膽固醇、血糖和腸上皮完整性的影響

HFD-LE組、HFD-HE組均未顯著降低HFD導(dǎo)致的小鼠血清CHO、TG、LDL和HDL的升高（圖3A-3D）。緊密連接蛋白（ZO-1）和閉合蛋白是腸道上皮和屏障功能完整的重要生物標(biāo)志物，其表達(dá)的減少顯著細(xì)胞外通透性增加。高濃度的NLE（HFD-HE組）顯著恢復(fù)了HFD造成的閉合蛋白基因mRNA轉(zhuǎn)錄的降低（圖3H）。NLE對閉合蛋白基因表達(dá)影響的劑量依賴性在West Blot試驗(yàn)中也有體現(xiàn)（圖3I）。

?圖3. A-F：NLE對小鼠血脂、膽固醇、葡萄糖和胰島素耐受性的影響；G-I：NLE對小鼠緊密連接蛋白（ZO-1）和閉合蛋白的影響

4. 菱形藻（Nitzschia laevis）對小鼠腸道微生物的影響

HFD導(dǎo)致小鼠腸道菌群的多樣性降低，然而NLE恢復(fù)了菌群多樣性（圖4）。Proteobacteria?、Epsilonproteobacteria、Helicobacteraceae?和Campylobacterales在HFD-HE組顯著富集（圖5H;5I），NCD與HFD-HE組的菌群結(jié)構(gòu)差異較?。▓D5J）， NLE提高了HFD-HE和HFD-LE組Campylobacterales的豐度（圖5K）。NLE恢復(fù)了部分HFD導(dǎo)致的[K]轉(zhuǎn)錄和[G]碳水化合物代謝與運(yùn)輸?shù)墓δ茴愋停▓D5L）。

?圖4.?NLE對小鼠腸道微生物α多樣性（A-J）和菌群結(jié)構(gòu)（K-O）的影響

圖5.?NLE對小鼠腸道微生物基因功能的影響

總結(jié)

菱形藻（Nitzschia laevis）能夠有效地緩解高脂肪攝食（HFD）導(dǎo)致的肥胖癥狀，能夠有效地恢復(fù)小鼠腸道微生物的結(jié)構(gòu)和功能。

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]]> 【項目文章】褪黑素通過調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群預(yù)防肥胖 http://specchiomagico.net/archives/12314 Mon, 18 Dec 2017 02:47:06 +0000 http://specchiomagico.net/?p=12314 Melatonin?prevents?obesity?through?

modulation?of?gut?microbiota?in?mice?

褪黑素通過調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群預(yù)防肥胖

IF：9.314 期刊：Journal of Pineal Research

時間：2017.03 ?單位：北京師范大學(xué) 、百邁客生物科技

研究背景

肥胖是一個非常嚴(yán)重的健康威脅因素，在2014年全球體重超標(biāo)的成年人達(dá)到20億，其中至少有6億是肥胖癥。有大量研究表明肥胖是癌癥和一些慢性疾病，如糖尿病、脂肪肝、心血管疾病等的風(fēng)險因素?，F(xiàn)如今肥胖已經(jīng)超越吸煙，成為世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的健康威脅。目前研究表明腸道菌群失調(diào)會導(dǎo)致肥胖及其并發(fā)癥的發(fā)生。已有研究揭示褪黑素可以促進(jìn)體重的下降以及自身能量的平衡，但是褪黑素的益生作用是否與腸道微生態(tài)有關(guān)，目前尚未報導(dǎo)。而本研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素是通過改變腸道微生物結(jié)構(gòu)來預(yù)防肥胖及其并發(fā)疾病。

 

研究方法

小鼠隨機(jī)分為3組，NCD（正常膳食）、HFD（高脂肪膳食）、HFD+M（高脂肪膳食+褪黑素）

Illumina?MiSeq；16S?rRNA?V3+V4;

組織學(xué)分析，生化分析，葡萄糖和胰島素耐受分析，蛋白質(zhì)印記分析。

研究成果

1，?褪黑素能顯著地控制體重增加

1）?HFD組小鼠體重顯著增加，而HFD+褪黑素組小鼠體重得到有效控制，如下圖A。

2）分離小鼠四類主要的脂肪組織（Epi-WAT、Mes-WAT、Per-WAT、Ing-SAT），發(fā)現(xiàn)HFD顯著促進(jìn)這四類脂肪組織重量的增加，而褪黑素能有效抑制這四類脂肪組織重量的增加，如下圖B-E。

2，?褪黑素能控制白色脂肪組織，脂肪肝，系統(tǒng)性炎癥

1）?通過比較Epi-WAT脂肪細(xì)胞的大小，發(fā)現(xiàn)HFD組脂肪細(xì)胞顯著增大；而褪黑素通過減少>12000μm2的細(xì)胞數(shù)目，增加2000–8000μm2的細(xì)胞數(shù)目，使HFD+褪黑素組脂肪細(xì)胞大小維持在正常范圍內(nèi)，如下圖A-C。

2）?通過比較Epi-WAT脂肪生成基因（FAS和ACC-1）的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)HFD顯著促進(jìn)FAS和ACC-1的表達(dá)，而褪黑素顯著抑制FAS基因的表達(dá)，如下圖D和E。

3）?通過觀察油紅O染色及比較肝臟TC含量，發(fā)現(xiàn)褪黑素能顯著抑制肝臟內(nèi)脂質(zhì)積累，如下圖F和G。

4）?通過比較血液內(nèi)毒素（LPS）和炎癥性細(xì)胞因子（TNFα和IL-6）的水平，發(fā)現(xiàn)褪黑素能顯著抑制內(nèi)毒素血癥和系統(tǒng)性炎癥的發(fā)生，如下圖H-K。

3，?褪黑素能改善葡萄糖耐受性及胰島素抗性

1）?通過比較血脂含量，發(fā)現(xiàn)HFD顯著提高TG和TC含量，而褪黑素能顯著降低TG和TC的含量，如下圖A和B。

2）?通過比較血糖和胰島素含量，并推導(dǎo)HOMA-IR和QUICKI指數(shù)，發(fā)現(xiàn)褪黑素能有效保護(hù)胰島素敏感性，并且使血糖和胰島素的含量發(fā)生顛倒，從而使HOMA-IR和QUICKI指數(shù)趨于正常水平，如下圖C-F。

3）?通過葡萄糖耐受試驗(yàn)（IPGTT）和胰島素耐受試驗(yàn)（ITT）分析，發(fā)現(xiàn)褪黑素能顯著改善葡萄糖耐受性及胰島素抗性，如下圖G和H。

 

4，?褪黑素能促進(jìn)棕色脂肪組織褐變及產(chǎn)熱

1）?通過棕色脂肪組織（BAT）石蠟切片分析，發(fā)現(xiàn)HFD促進(jìn)脂質(zhì)積累（切片白化），而褪黑素表現(xiàn)出相反的作用，并且褪黑素促進(jìn)BAT中UCP1蛋白的表達(dá)，如下圖A。

在BAT中，褪黑素顯著增強(qiáng)產(chǎn)熱基因UCP1和UCP3的表達(dá)，如下圖B和C；線粒體生物合成基因PGC1α，脂肪酸分解代謝基因CPT1β，脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)基因CD36?和FABP的表達(dá)量也有提高，盡管未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)的顯著性，如下圖D-G。

5，?褪黑激素改變腸道微生物結(jié)構(gòu)

1）?通過對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)褪黑素能顯著降低OTU的數(shù)目以及微生物的豐富度和多樣性，如下圖A-H。

2）?門水平菌落結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)HFD顯著降低擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對豐度，而顯著提高厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度。而褪黑素的加入會降低厚壁菌門/擬桿菌門的比例，并且會顯著提高疣微菌門（verrucomicrobia）的相對豐度，如下圖I。

3）?屬水平菌落結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)褪黑素顯著提高Akkermansia的相對豐度，Akkermansia屬于疣微菌門（verrucomicrobia），如下圖J。

4）?UPGMA、NMDS、PCA、PCoA分析，發(fā)現(xiàn)褪黑素顯著改變了腸道菌群的結(jié)構(gòu)，如下圖K-N。

6，褪黑素能調(diào)節(jié)腸道菌群中的標(biāo)志微生物

1) ?如下圖顯示，在三個分組中一共找到85個相對豐度有顯著差異的OUT。與NCD組相比，HFD組有27個相對豐度顯著增高的OTU，42個顯著降低的OTU。與HFD組相比，添加了褪黑素的組有10個相對豐度顯著增高的OTU，20個顯著降低的OTU；而在這30個差異性的OTU中，有14個OTU的變化方向與和NCD組比較的結(jié)果完全相反。這14個OTU屬于Ruminococcaceae、Desulfovibrionaceae、Bacteroides、Porphyromonadaceae、Helicobacteraceae、Christensenellaceae，有研究表明這些微生物與肥胖相關(guān)。

2) LEfSe分析，發(fā)現(xiàn)褪黑素顯著提高Akkermansia的相對豐度，Akkermansia即是降低高脂肪膳食小鼠體重的有益菌。而褪黑素顯著降低Alistipes、Anaerotruncus、Helicobacter?marmotae的相對豐度，則這三種細(xì)菌預(yù)防肥胖的有害菌?？傊?，褪黑素能夠使高脂肪膳食小鼠的腸道菌群由失調(diào)狀態(tài)轉(zhuǎn)為正常狀態(tài)，從而抑制體重的增加。

參考文獻(xiàn)：

Xu?P,?Wang?J,?Hong?F,?et?al.?Melatonin?prevents?obesity?through?modulation?of?gut?microbiota?in?mice[J].?Journal?of?Pineal?Research,?2017.

 

 

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