免疫組庫(Immune Repertoire,IR)是B/T淋巴細胞抗原受體多樣性檢測,即BCR/TCR的多樣性。BCR和TCR一般由可變區(qū)(V區(qū))、多變區(qū)(D區(qū))、連接區(qū)(J區(qū))、恒定區(qū)(C區(qū))構(gòu)成, V(D)J區(qū)域在遺傳過程中發(fā)生重排或重組,形成大量不同的組合形式,導(dǎo)致BCR和TCR基因序列多樣性極其豐富,這些序列多樣性集合稱為免疫組庫。
單細胞免疫組庫測序(scVDJ-seq )是基于10x Genomics平臺的微流控和油滴包裹技術(shù),在單細胞水平同時檢測轉(zhuǎn)錄組基因表達和TCR/BCR多樣性,不但可以了解TCR/BCR克隆型,還可以聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)深入挖掘生命機理,為免疫組學(xué)研究提供更高效的平臺,在腫瘤微環(huán)境、感染性疾病、自身免疫疾病等研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。
利用10× Genomics平臺完成單細胞的分離、反轉(zhuǎn)錄成cDNA后,將cDNA一分為二,同時進行TCR/BCR的V(D)J建庫和5’單細胞轉(zhuǎn)錄本建庫,并連接測序引物,獲得每個細胞5’基因表達數(shù)據(jù)和V(D)J全長序列信息,獲得數(shù)據(jù)進行細胞亞群聚類、細胞表達特征、標記分子篩選、免疫組庫克隆型等分析。
一般來說B細胞或者T細胞受體TCR/BCR傳統(tǒng)研究存在很多局限性,其建庫基于對TCR/BCR特征序列的捕獲,只能使用多重PCR、5’RACE來研究CDR3區(qū)域,無法獲得V(D)J基因全長序列、重鏈輕鏈/αβ鏈配對信息、T/B細胞克隆之間的關(guān)系、受體與特定抗原之間的對應(yīng)關(guān)系等。此外,傳統(tǒng)免疫組庫研究基于細胞群體,單個或少量細胞研究往往受限。自2015年10x Genomics 平臺的推出,大大加快了免疫組庫研究領(lǐng)域的應(yīng)用,同時實現(xiàn)了單細胞水平的高分辨,解決傳統(tǒng)方法的局限性,降低了單細胞免疫組庫研究的門檻。
10x Genomics | 5’RACE | 多重PCR | |
---|---|---|---|
檢測原理 | 多重PCR | 從低豐度的轉(zhuǎn)錄本快速擴增cDNA的5‘末端 | 多重PCR |
擴增區(qū)域 | 全長 | CDR | CDR3 |
雙鏈匹配 | 精準匹配兩個BCR/TCR鏈對 | 只能檢測TCR和BCR一條鏈的序列信息 | 只能檢測TCR和BCR一條鏈的序列信息 |
優(yōu)點 | VDJ全長;
TCR/BCR同時檢測; 一次分析上千個單細胞TCRα/β和BCR重鏈和輕鏈信息和基因表達重復(fù)性高 |
可最*程度避免PCR擴增偏向性 | 不用打斷,數(shù)據(jù)完整 |
缺點 | 組織樣本制備單細胞懸液比較復(fù)雜 | 操作繁瑣,實驗打斷會丟失部分序列,重復(fù)性不如多重PCR | PCR擴增偏向性 無法檢測V等位基因的突變信息 |
單細胞表達 | 可同時獲得單細胞表達譜 | 無法實現(xiàn) | 無法實現(xiàn) |
通過單細胞免疫組庫測序獨特的V(D)J數(shù)據(jù),√確匹配完全相同的有效CDR3核酸系列的Cell barcodes組合在一起,稱為克隆型。單細胞免疫組庫測序可以分析CDR3克隆型及每個克隆型包含的細胞的數(shù)目。通過克隆型的鑒定可以對細胞進一步分群,并通過優(yōu)勢克隆尋找特殊的細胞類型,指導(dǎo)耐藥機制、疫苗抗體研發(fā)、腫瘤治療等方面研究,利于揭示免疫組庫克隆性、多樣性、抗原特異性和細胞微環(huán)境。
單細胞免疫組庫數(shù)據(jù)利用10x 官網(wǎng)軟件 Cell ranger V(D)進行處理,主要有clontypes鑒定分析、樣本相關(guān)性、CDR3特征分析、 V/D/J基因使用頻率分析等。具體詳情見解析:10x單細胞免疫組庫VDJ數(shù)據(jù)分析就看它
了解腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的表型,對于癌癥進展和免疫治療反應(yīng)的研究至關(guān)重要。研究者使用單細胞RNA測序分析了來自8位原發(fā)性乳腺癌患者的45,000個免疫細胞,觀察到正常免疫細胞與腫瘤組織中免疫細胞之間有顯著相似性,但后者針對腫瘤微環(huán)境出現(xiàn)特異性連續(xù)表型擴展;并通過單細胞免疫組庫測序檢測另外27,000個T細胞轉(zhuǎn)錄組基因表達和T細胞受體(TCR)多樣性,結(jié)果揭示了TCR組合使用對表型多樣性的影響。單細胞免疫組庫和單細胞RNA數(shù)據(jù)聯(lián)合分析更有利于研究腫瘤微環(huán)境、尋找免疫治療的靶點,輔助腫瘤診療。
文獻原文:Single-cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment. 2018, Cell, IF=38.637
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