Nanopore全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

nanopore全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是指基于牛津納米孔公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）三代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，無(wú)需打斷，基于三代測(cè)序平臺(tái)直接獲取轉(zhuǎn)錄本的5ˊ到3ˊ高質(zhì)量全長(zhǎng)序列，可準(zhǔn)確識(shí)別可變剪接、基因融合、可選擇性多聚腺苷酸化APA、等位基因特異性表達(dá)等轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)方面變異?；趎anopore三代測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，除了可準(zhǔn)確鑒別上述轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異，還可實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本（mRNA或polyA+ lncRNA）表達(dá)水平準(zhǔn)確定量。

主要在于測(cè)序平臺(tái)不同。Illumina平臺(tái)主要是PE150測(cè)序，構(gòu)建小片段文庫(kù)，為邊合成邊測(cè)序，在建庫(kù)以及測(cè)序過(guò)程中均需要PCR擴(kuò)增，主要用于基因水平表達(dá)定量及差異表達(dá)分析。nanopre全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序無(wú)需打斷RNA，可獲得5’到3’全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本序列及其表達(dá)信息，對(duì)片段大小無(wú)偏好，直接檢測(cè)電信號(hào)無(wú)需邊合成邊測(cè)序其GC偏好性遠(yuǎn)低于二代平臺(tái)；同時(shí)由于無(wú)需拼接其在轉(zhuǎn)錄本層面的結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)方面，比如可變剪接、融合基因、APA、新基因預(yù)測(cè)等具有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。

nanopore測(cè)序是基于電信號(hào)識(shí)別堿基序列的三代測(cè)序技術(shù)。DNA/RNA上不同堿基或帶不同修飾時(shí)化學(xué)性質(zhì)存在差異，當(dāng)單鏈分子通過(guò)納米孔通道時(shí)，堿基造成的阻礙大小不一，因此會(huì)形成特征性離子電流變化信號(hào)。通過(guò)對(duì)這些信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)，即可獲得相應(yīng)堿基類(lèi)型，完成測(cè)序。目前通過(guò)“遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Recurrent Neural Network）”的復(fù)雜算法對(duì)堿基進(jìn)行判讀。

其特點(diǎn)為：

1）讀長(zhǎng)長(zhǎng)：最長(zhǎng)讀長(zhǎng)能達(dá)到2 Mb以上級(jí)別[ref1]，有利于可變剪接、基因融合等結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)；
2）低成本：相比其他三代測(cè)序技術(shù)，ONT測(cè)序樣本處理極其簡(jiǎn)單，無(wú)需DNA聚合酶、連接酶和dNTPs，測(cè)序價(jià)格低；
3）測(cè)序過(guò)程不涉及PCR擴(kuò)增：避免二代測(cè)序中PCR擴(kuò)增可能引入的錯(cuò)誤或豐度變化；
4）direct-RNA/DNA方式建庫(kù)，可直接獲取堿基修飾信息，如甲基化修飾5mC、6mA等，無(wú)須像二代測(cè)序需要經(jīng)過(guò)重硫酸鹽轉(zhuǎn)化或者免疫沉淀富集實(shí)驗(yàn)；
5）低GC含量和堿基偏好性，針對(duì)RNA測(cè)序無(wú)需打斷，轉(zhuǎn)錄本水平表達(dá)定量更準(zhǔn)確。

二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序一般基于邊合成邊測(cè)序二代短讀長(zhǎng)的Illumina等平臺(tái)，由于讀長(zhǎng)短（通常PE 150bp），需要進(jìn)行片斷化，打斷到200-300bp，測(cè)序過(guò)程需要DNA聚合酶和dNTPs以及進(jìn)行橋式PCR形成clusters放大熒光信號(hào)。
從二代轉(zhuǎn)錄組到nanopore三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組，平臺(tái)升級(jí)，技術(shù)革新，解決二代不能解決的問(wèn)題！

樣品類(lèi)型：PolyA RNA；樣品濃度：≥50 ng/ul（Qubit HS RNA定量）； 樣品總量：cDNA-direct方式：>250ng（單次）；總量>750 ng；（若提供總RNA，動(dòng)物樣品總量需按照PolyA RNA要求的100倍以上準(zhǔn)備）； cDNA-PCR方式：>1μg（單次）；總量>3μg 樣品純度：OD260/280 ~2.0，OD260/230在2.0-2.2 之間，260nm處有正常峰值；樣品無(wú)基因組DNA污染； 總RNA完整性： RIN值≥8.0，28S/18S≥1.0；圖譜基線無(wú)上抬；5S峰正常。

研究表明，生物學(xué)重復(fù)可提高所有基因表達(dá)水平鑒定的準(zhǔn)確性，而增加測(cè)序深度主要提高低表達(dá)基因表達(dá)量鑒定準(zhǔn)確性。每種處理?xiàng)l件下至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，當(dāng)研究樣本的生物學(xué)差異比較高，或者想研究更多的微小表達(dá)差異/fold change時(shí)，需要更多生物學(xué)重復(fù)。也就是，比如對(duì)于個(gè)體差異較大的臨床樣本可以5-10個(gè)/組以上，而生物學(xué)差異較小的細(xì)胞系樣本則每組3個(gè)生物學(xué)重復(fù)以上即可。

• 首先，轉(zhuǎn)錄本表達(dá)定量，是指針對(duì)一個(gè)基因的多個(gè)不同轉(zhuǎn)錄本(transcript)分別進(jìn)行表達(dá)定量。而基因水平定量，可以理解為一個(gè)基因所有轉(zhuǎn)錄本表達(dá)定量的加和。
• 多數(shù)公司二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序不提供一個(gè)基因的多個(gè)轉(zhuǎn)錄本分別定量的結(jié)果，原因在于二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并適用于這種情況。二代短測(cè)序單條read無(wú)法跨越全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，其表達(dá)定量在reads比對(duì)完成后需要用諸如StringTie等軟件進(jìn)行短reads組裝拼接得到轉(zhuǎn)錄本再進(jìn)行其表達(dá)量評(píng)估。
• 那么，二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可能會(huì)存在拼接錯(cuò)誤或者是拼接不完整，不能準(zhǔn)確獲得完整轉(zhuǎn)錄本，導(dǎo)致各個(gè)轉(zhuǎn)錄本水平表達(dá)定量不準(zhǔn)確。
• 尤為重要的是，二代測(cè)序?qū)τ谝粋€(gè)基因的多個(gè)轉(zhuǎn)錄本得到的reads，尤其是多個(gè)轉(zhuǎn)錄本共享的外顯子區(qū)對(duì)應(yīng)reads無(wú)法區(qū)分其來(lái)源轉(zhuǎn)錄本，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本水平定量不準(zhǔn)確。
• 還有一些情況，當(dāng)不同基因具有比較相似的高度保守區(qū)時(shí)，這些區(qū)域的短reads也無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分其來(lái)源基因/轉(zhuǎn)錄本，即存在多比對(duì)的現(xiàn)象，這也導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本甚至基因水平表達(dá)定量存在偏倚。
• nanopore三代全長(zhǎng)測(cè)序無(wú)需對(duì)各轉(zhuǎn)錄本打斷和拼接，一條read即可跨越全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，多比對(duì)率也比較低，因此能夠準(zhǔn)確獲取一個(gè)基因的多個(gè)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本各自的表達(dá)信息。

注：上圖中藍(lán)色方塊表示測(cè)到RNA序列中能夠比對(duì)到基因組序列的區(qū)域，即屬于某個(gè)轉(zhuǎn)錄本外顯子區(qū)的reads；灰色線條表示我們測(cè)到的reads回比基因組序列時(shí)中間沒(méi)有比對(duì)上的，則用灰色線條連接，即reads不連續(xù)比對(duì)，中間被剪接掉的內(nèi)含子區(qū)。從圖中明顯看出，二代短reads比較短，多數(shù)短read單條連一個(gè)外顯子區(qū)都跨越不了，nanopore長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序可以直接得到3種全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本。其中，Exon2和Exon6以及Exon9是三個(gè)轉(zhuǎn)錄本間共享的，那么對(duì)于完全比對(duì)到這3個(gè)外顯子區(qū)的短reads無(wú)法區(qū)分其來(lái)源轉(zhuǎn)錄本。而三代測(cè)序則直接跨越三個(gè)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，因此對(duì)于轉(zhuǎn)錄本水平表達(dá)定量更準(zhǔn)確。

• 來(lái)自同一基因的多個(gè)轉(zhuǎn)錄本可能行使不同功能，二代測(cè)序由于片段化測(cè)序?qū)е聦?duì)轉(zhuǎn)錄本水平定量不準(zhǔn)確，對(duì)于轉(zhuǎn)錄本水平表達(dá)定量存在固有缺陷，nanopore三代測(cè)序彌補(bǔ)了此方面不足，尤其是對(duì)于基因水平不顯著差異表達(dá)的基因，該基因的某些轉(zhuǎn)錄本可能顯著差異表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄本可能具有重要生物學(xué)作用。比如有些基因的某些轉(zhuǎn)錄本只在特定條件下才表達(dá)。如果不能對(duì)轉(zhuǎn)錄本水平進(jìn)行準(zhǔn)確定量，則可能遺漏這些可能具有重要生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄本。

• 人類(lèi)中約95%基因存在可變剪接AS事件、70%以上基因存在APA現(xiàn)象[ref3]。AS、APA和fusion等是轉(zhuǎn)錄本多樣性以及蛋白多樣性的來(lái)源，多樣性轉(zhuǎn)錄本或蛋白發(fā)揮不同功能。

• 由于全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本序列的獲得，使得nanopore全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在鑒定可變剪接（alternative splicing, AS）、可選擇性多聚腺苷酸化（APA）以及融合轉(zhuǎn)錄本（fusion transcripts）等轉(zhuǎn)錄本層面的結(jié)構(gòu)變異更準(zhǔn)確，這是之前三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序廣為熟知的應(yīng)用。
• 目前利用二代Illumina高通量測(cè)序方法進(jìn)行可變剪切的檢測(cè)與分析非常普遍，但由于二代測(cè)序的讀長(zhǎng)短，在準(zhǔn)確預(yù)測(cè)完整的isoform全長(zhǎng)序列方面存在問(wèn)題，同時(shí)存在難以判斷轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）和轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)（TTS）的位置、難以判斷哪些外顯子是連接在一起的問(wèn)題。
• 針對(duì)同時(shí)發(fā)生多個(gè)外顯子跳躍和內(nèi)含保留等復(fù)雜轉(zhuǎn)錄本鑒定更是無(wú)能為力。

• 利用二代短序列測(cè)序來(lái)檢測(cè)融合基因存在一些問(wèn)題：基因組重復(fù)序列以及多比對(duì)率比較高使得檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。
• 二代測(cè)序技術(shù)中為了研究APA已經(jīng)開(kāi)發(fā)了不下于10種實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法，比如polyA-seq，雖然其可以提取準(zhǔn)確的polyA位置，但oligo(dT)引物可能結(jié)合到轉(zhuǎn)錄本內(nèi)部的連續(xù)A序列，導(dǎo)致假陽(yáng)性率高，后續(xù)需要RNA Pol II結(jié)合等額外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這些連續(xù)A序列確實(shí)是由APA引起的；而如果不進(jìn)行專(zhuān)門(mén)的polyA-seq，普通的二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)PA檢測(cè)效能低下，只能鑒定到約0.003％含有polyA的reads，并且短3’UTR通常嵌在長(zhǎng)的UTR中，因此具有短3’UTR的isoform通常被轉(zhuǎn)錄組裝工具忽視。[ref5]
• nanopore三代全長(zhǎng)測(cè)序無(wú)需對(duì)各轉(zhuǎn)錄本打斷和拼接，poly(A)會(huì)出現(xiàn)在測(cè)序結(jié)果中，并且可以得到從5’到3’的完整全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，其多比對(duì)率也比較低，因此能夠準(zhǔn)確鑒定轉(zhuǎn)錄本水平各結(jié)構(gòu)變異。

使用三種納米孔建庫(kù)方式（PCR-cDNA、direct-cDNA和direct-RNA）數(shù)據(jù)和典型的短讀長(zhǎng)cDNA技術(shù)制備酵母轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)進(jìn)行比較：

a）在所有情況下，納米孔長(zhǎng)讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)集的GC偏好都比短讀長(zhǎng)數(shù)據(jù)集低。

b）與短讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)相比，納米孔長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序數(shù)據(jù)的長(zhǎng)度偏倚都較小。

綜上，nanopore全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序受基因的GC含量和長(zhǎng)度偏好更小。

——圖片來(lái)源于Oxford Nanopore Technologies官方白皮書(shū)The value of full-length transcripts without bias。

ONT平臺(tái)目前我司下機(jī)數(shù)據(jù)堿基質(zhì)量Q值平均約在10左右，即堿基平均錯(cuò)誤率為10^(-1)=10%左右，但這是單堿基錯(cuò)誤率；

比對(duì)時(shí)用的是全長(zhǎng)序列和參考基因組或參考轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比對(duì)，序列越長(zhǎng)比對(duì)時(shí)對(duì)于堿基錯(cuò)配度容忍越高，因此不會(huì)對(duì)表達(dá)定量有影響；

當(dāng)然由于比二代單堿基錯(cuò)誤率高，故而百邁客將SNP和InDel檢測(cè)分析內(nèi)容去除了，因此想從RNA水平檢測(cè)snp/indel的客戶(hù)可能考慮做二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。其實(shí)目前不乏使用nanopore測(cè)序數(shù)據(jù)檢測(cè)snp的文章，如NC|nanopore全基因組重測(cè)序鑒定人類(lèi)基因組非同義新生SNP。

下面列舉了2個(gè)百邁客真實(shí)項(xiàng)目的數(shù)據(jù)質(zhì)量表，大家可以參考。

ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序一條reads即代表該轉(zhuǎn)錄本表達(dá)一次，而二代短reads需要非常多條才能覆蓋一個(gè)轉(zhuǎn)錄本；oxford nanopore公司官方白皮書(shū)中數(shù)據(jù)顯示：當(dāng)相同數(shù)量的轉(zhuǎn)錄本被覆蓋達(dá)95%時(shí)，ONT所需要的reads數(shù)比Illumina約少50倍，所需要堿基數(shù)約少7倍。

故而2G ONT數(shù)據(jù)能達(dá)到6G Illumina檢測(cè)效果；

——圖片來(lái)源于Oxford Nanopore Technologies官方白皮書(shū)The value of full-length transcripts without bias。

針對(duì)同一樣本進(jìn)行的飽和度分析顯示，2G ONT全長(zhǎng)除表達(dá)量極低的（CPM<1）其他轉(zhuǎn)錄本都達(dá)到飽和了，和二代Illumina 6G除表達(dá)量極低FPKM<1外的基因檢測(cè)也飽和了，且前者更早趨向飽和；

目前已發(fā)表的人鼠文獻(xiàn)中ONT全長(zhǎng)測(cè)序的數(shù)據(jù)量大多也不到2G，比如文獻(xiàn)精讀|nanopore全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序揭示B細(xì)胞表面受體廣泛的轉(zhuǎn)錄變異。

應(yīng)用于慢性淋巴細(xì)胞白血病

英文題目：Full-length transcript characterization of SF3B1 mutation in chronic lymphocytic leukemia reveals downregulation of retained introns
發(fā)表雜志：Nature Communications
發(fā)表時(shí)間：2020.03
影響因子：11.878
使用Nanopore分別對(duì)慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL）分離的SF3B1野生型，突變株和正常組B細(xì)胞樣本進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?；贜anopore的全長(zhǎng)cDNA測(cè)序可以檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)，通過(guò)算法優(yōu)化，相對(duì)于短序列，可以更準(zhǔn)確的檢測(cè)3′末端剪切，內(nèi)含子保留，分辨生產(chǎn)性異構(gòu)體和非生產(chǎn)性異構(gòu)體。該研究證明了Nanopore測(cè)序在癌癥和可變剪切中的潛在使用價(jià)值。

應(yīng)用于精神疾病

英文題目：Long-read sequencing reveals the complex splicing profile of the psychiatric risk gene CACNA1C in human brain
發(fā)表雜志：Mol. Psychiatry
發(fā)表時(shí)間：2020.03
影響因子：11.973
在人腦中，與精神分裂癥相關(guān)的基因組區(qū)域富集了在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中表現(xiàn)出不同異構(gòu)體使用的基因，本文通過(guò)ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究疾病相關(guān)的CACNA1C亞型，有可能提供既有效又無(wú)外周副作用的新型精神藥物。

應(yīng)用于阿爾茨海默病

英文題目：Deleterious ABCA7 mutations and transcript rescue mechanisms in early onset Alzheimer’s disease
發(fā)表雜志：Acta Neuropathol
發(fā)表時(shí)間：2017.09
影響因子：14.251
阿爾茨海默病（AD）是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。本文研究了ABCA7 PTC突變?cè)谝粋€(gè)大型早發(fā)性AD對(duì)照隊(duì)列中的患病率和疾病外顯性，并用ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組檢查了其對(duì)轉(zhuǎn)錄水平的影響。揭示了不同程度的NMD和轉(zhuǎn)錄修飾事件，可能影響ABCA7的劑量、疾病的嚴(yán)重程度，并可能為AD的治療干預(yù)創(chuàng)造機(jī)會(huì)。

應(yīng)用于多囊腎病

英文題目：Human-Specific Abnormal Alternative Splicing of Wild-Type PKD1 Induces Premature Termination of Polycystin-1
發(fā)表雜志：Journal of The American Society of Nephrology
發(fā)表時(shí)間：2018.10
影響因子：9.274
常染色體顯性遺傳性多囊腎病的主要形式是由編碼多囊蛋白-1(PC1)的基因雜合突變引起的，通過(guò)ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等方法確認(rèn)存在多種剪接形式。研究發(fā)現(xiàn)，在雜合子個(gè)體中，低水平的全長(zhǎng)PC1可能會(huì)將多囊蛋白信號(hào)降低到臨界的“成囊”閾值以下。

應(yīng)用于乳腺癌

英文題目：Nanopore sequencing of full-length BRCA1 mRNA transcripts reveals co-occurrence of known exon skipping events
發(fā)表雜志：Breast Cancer Res
發(fā)表時(shí)間：2017.11
影響因子：4.988
本研究探索了納米孔測(cè)序技術(shù)在檢測(cè)整個(gè)BRCA1 mRNA轉(zhuǎn)錄本以及對(duì)框內(nèi)和框外剪接事件進(jìn)行準(zhǔn)確分類(lèi)方面的應(yīng)用。研究鑒定了32個(gè)完整的BRCA1亞型，其中包括18個(gè)新的亞型，還發(fā)現(xiàn)已知的BRCA1外顯子跳躍事件，如Δ(9，10)和Δ21。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)預(yù)測(cè)剪接轉(zhuǎn)錄本的翻譯框架具有重要意義，對(duì)解釋剪接變異體的臨床意義也很重要。

應(yīng)用于肺癌

英文題目：Long read sequencing reveals a novel class of structural aberrations in cancers:identification and characterization of cancerous local amplifications
bioRxiv
本研究中利用ONT全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組和ONT重測(cè)序技術(shù)在肺癌基因組中識(shí)別和表征結(jié)構(gòu)畸變，揭示了由局部重復(fù)、倒位和微缺失的復(fù)雜組合組成的獨(dú)特結(jié)構(gòu)畸變CLCL，進(jìn)一步分析并發(fā)現(xiàn)，即使在關(guān)鍵的癌癥相關(guān)基因中，這些突變也發(fā)生在體內(nèi)，這些突變可能闡明了致癌性事件和治療策略仍然難以捉摸的患者的分子病因。

應(yīng)用于細(xì)胞表面受體

英文題目：Nanopore long-read RNAseq reveals widespread transcriptional variation among the surface receptors of individual B cells
發(fā)表雜志：Nature Communications
發(fā)表時(shí)間：2017.07
影響因子：12.121
短reads RNAseq解析復(fù)雜isoform的能力有限，因?yàn)樗鼰o(wú)法測(cè)序RNA分子的全長(zhǎng)cDNA拷貝。作者研究了使用長(zhǎng)讀取單分子Oxford Nanopore測(cè)序儀的RNAseq是否能夠在不犧牲準(zhǔn)確的基因表達(dá)定量的情況下，鑒定和定量復(fù)雜的isoform。在小鼠B1a細(xì)胞中鑒定了數(shù)千個(gè)未注釋的轉(zhuǎn)錄起始和終止位點(diǎn)，以及數(shù)百個(gè)可變剪接事件，鑒定了在B1a細(xì)胞中表達(dá)的數(shù)百種基因，這些基因顯示出多種復(fù)雜的isoform，包括幾種B細(xì)胞特異性表面受體。本研究表明，可以在單細(xì)胞水平上識(shí)別和定量復(fù)雜的isoform。