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Small RNA測序

研究RNA功能及調(diào)控機(jī)制的有力工具

產(chǎn)品介紹

 

Small RNA（sRNA）在細(xì)胞內(nèi)具有多種重要的調(diào)節(jié)作用，主要通過miRNA與靶mRNA特異性結(jié)合調(diào)控靶mRNA的表達(dá)，從而參與許多生命過程，如細(xì)胞增殖、 細(xì)胞凋亡、脂肪代謝和細(xì)胞分化等。Small RNA（sRNA）測序是利用illumina測序平臺檢測已知和未知miRNA的表達(dá)水平及其表達(dá)差異，結(jié)合同一樣本的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)進(jìn)行聯(lián)合分析，可以同時分析miRNA及其靶基因的表達(dá)情況，為研究RNA的功能及調(diào)控機(jī)制提供有力的工具。

miRNA鑒定

miRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)多位于基因間隔區(qū)、內(nèi)含子以及編碼序列的反向互補(bǔ)序列上，其前體具有標(biāo)志性的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，成熟體的形成是由Dicer/DCL酶的剪切實(shí)現(xiàn)的。對于已知miRNA的鑒定，我們將比對上參考基因組的reads序列與已知miRNA數(shù)據(jù)庫miRBase（v22）中的成熟miRNA序列進(jìn)行比對。針對miRNA的生物特征，對于未鑒定到已知miRNA的序列，百邁客利用miRDeep2軟件進(jìn)行新miRNA的預(yù)測。

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基因表達(dá)水平分析

利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)檢測基因表達(dá)具有較高的靈敏度。通過TPM密度圖不僅可以反映單個樣品miRNA的整體表達(dá)模式和離散程度，還可以直觀的比較不同樣品的整體基因表達(dá)水平差異。

差異表達(dá)miRNA聚類分析

聚類分析用于判斷差異基因在不同實(shí)驗(yàn)條件下的表達(dá)模式，可通過將表達(dá)模式相同或相近的基因聚集成類，從而識別未知基因的功能或已知基因的未知功能，同類基因可能具有相似的功能或共同參與同一代謝過程。對篩選出的差異表達(dá)miRNA做層次聚類分析，將具有相同或相似表達(dá)行為的miRNA進(jìn)行聚類。

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差異miRNA靶基因注釋

生物體內(nèi)，在特定條件下某些基因?qū)?yīng)的轉(zhuǎn)錄本會形成miRNA前體，失去編碼功能，或者通過種子區(qū)域與目的基因進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致基因的表達(dá)受到抑制或降解，從而影響生物學(xué)表型。因此，針對miRNA的靶基因分別進(jìn)行GO和KEGG注釋及富集分析，有助于深入挖掘小RNA功能。

?專業(yè)項(xiàng)目方案設(shè)計 深度解析數(shù)據(jù)

從選材到后續(xù)研究內(nèi)容相關(guān)信息的挖掘，整個流程嚴(yán)謹(jǐn)進(jìn)行，全程跟蹤。

  • 實(shí)驗(yàn)設(shè)計

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公司成立多年以來，擁有豐富的項(xiàng)目分析經(jīng)驗(yàn)，累計完成1千多個樣品的sRNA項(xiàng)目研究，物種涉及廣泛，包括人鼠、動物、植物常見的組織部為及細(xì)胞樣本。可根據(jù)項(xiàng)目需要選擇方案，保障結(jié)果精準(zhǔn)。

Q1. sRNA測序?qū)τ跇颖居惺裁匆螅?/span>

答：sRNA測序產(chǎn)品可以對動植物、全血、細(xì)胞等組織或者核酸樣本進(jìn)行測序，分析要求需要有對應(yīng)物種的參考基因組，具體的送樣指導(dǎo)，請參考如下內(nèi)容：

Q2. 如何進(jìn)行動植物的miRNA的靶基因預(yù)測？

答：植物miRNA可與mRNA的編碼區(qū)完全互補(bǔ)配對，并通過誘導(dǎo)mRNA降解而發(fā)揮抑制表達(dá)的作用。動物miRNA則可與mRNA的3’UTR區(qū)部分互補(bǔ)配對結(jié)合，進(jìn)而抑制翻譯的進(jìn)行，一般的，miRNA與mRNA的配對區(qū)域位于miRNA的5’端的 2-8個堿基，稱為種子區(qū)，只要種子區(qū)能與mRNA互補(bǔ)配對即可發(fā)揮作用，這也是一個miNRA能夠調(diào)控數(shù)百條mRNA的原因。
我們根據(jù)已知miRNA和新預(yù)測的miRNA與對應(yīng)物種的基因序列信息，植物用 TargetFinder軟件進(jìn)行靶基因預(yù)測；動物用miRanda和targetscan進(jìn)行靶基因預(yù)測。

Q3. 目前對于小RNA靶基因的結(jié)果驗(yàn)證方法有哪些？

答：
RT-PCR對miRNA進(jìn)行定量驗(yàn)證；
miRNA過表達(dá)；
熒光素酶法，過表達(dá)miRNA測定靶基因表達(dá)量；把靶基因連上一個熒光素酶，如果靶基因表達(dá)量下降，可檢測到的熒光信號則減弱
降解組測序

Q4. miRNA命名規(guī)則是怎樣的？

答：
參照miRBase的命名規(guī)則：{物種名縮寫}-miR-{編號};miR-前綴后面所跟著的數(shù)字，代表命名的順序，比如，miR-124比miR-456發(fā)現(xiàn)得早。“miR-”代表成熟的miRNA、“mir-”代表pre-miRNA和pri-miRNA、“MIR”代表編碼miRNA的基因。
miRNA幾乎全是獨(dú)一的編碼順序，但對于擁有一兩個堿基不同的則會被標(biāo)上字母以示，例如，miR-124a與miR-124b。 若成熟的miRNA相同，但pre-miRNA和pri-miRNA和編碼他們的基因來自于不同的基因組，則使用數(shù)字來表示，例如，mir-194-1和mir-194-2表示兩個pre-， pri-miRNA剪切后的成熟miRNA是完全相同的，但卻是兩個不同的來源。
前綴的三個字母代表了不同的種族來源，例如，hsa-miR-194代表miRNA來源于人類，oar-miR-124來源于綿羊。
對于形成pre-，pri-miRNA莖環(huán)的兩端miRNA， 通常一端在數(shù)量上遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過另一端。數(shù)量優(yōu)勢的一端往往稱為guide strand，而另一端被稱為passenger strand，通常被大量降解，用*號來表示，例如miR-124和miR-124*。
最新版中miRBase已經(jīng)不再使用*來標(biāo)記microRNA與其發(fā)夾前體互補(bǔ)配對位置的互補(bǔ)序列，而是使用“-3p”與“-5p”作為區(qū)分這兩條序列的后綴替代舊的的命名法。(參考http://www.mirbase.org/help/nomenclature.shtml)
舉例： aly-miR158b-3p， aly 代表這是Arabidopsis lyrata 物種的miRNA, -miR158b表示這是成熟的miRNA , 其中b表示還有一個miRNA序列與它相似，僅有一兩個堿基不同。 -3p 表示它從前體的3’端剪切得到。
對新預(yù)測的miRNA 我們統(tǒng)一用 novel_miR_{數(shù)字編號} 來命名， 如 novel_miR_4974。

Q5. 如何進(jìn)行動植物的miRNA鑒定

答：
在已知miRNA鑒定方面，我們將比對到參考基因組的reads與miRBase（v22）數(shù)據(jù)庫中的已知miRNA的成熟序列及其上游2nt與下游5nt的范圍進(jìn)行比對，最多允許一個錯配，這樣鑒定到的reads被認(rèn)為是鑒定到的已知miRNA。
miRNA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)多位于基因間隔區(qū)、內(nèi)含子以及編碼序列的反向互補(bǔ)序列上，其前體具有標(biāo)志性的發(fā)夾結(jié)構(gòu)，成熟體的形成是由Dicer/DCL酶的剪切實(shí)現(xiàn)的。針對miRNA的生物特征，對于未鑒定到已知miRNA的序列，百邁客利用miRDeep2軟件進(jìn)行新miRNA的預(yù)測。
我們利用miRDeep2軟件包,通過reads比對到基因組上的位置信息得到可能的前體序列，基于reads在前體序列上的分布信息(基于miRNA產(chǎn)生特點(diǎn)，mature,star,loop)及前體結(jié)構(gòu)能量信息(RNAfold randfold)采用貝葉斯模型經(jīng)打分最終實(shí)現(xiàn)新miRNA的預(yù)測。miRDeep2主要用于動物miRNA的預(yù)測，通過參數(shù)的調(diào)整及打分系統(tǒng)的改變也可以對植物的miRNA進(jìn)行預(yù)測。