宏基因組（ONT）

產(chǎn)品介紹

ONT測(cè)序是新一代基于納米孔的單分子實(shí)時(shí)電信號(hào)測(cè)序技術(shù)，其各平臺(tái)的測(cè)序原理相同。DNA/RNA鏈在馬達(dá)蛋白的帶領(lǐng)下與鑲嵌在生物膜上的納米孔蛋白結(jié)合并解螺旋，在生物膜兩側(cè)電壓差的作用下，DNA/RNA鏈以一定的速率通過(guò)納米孔通道蛋白，由于DNA/RNA鏈上不同堿基化學(xué)性質(zhì)存在差異，所以當(dāng)單個(gè)堿基或DNA/RNA分子通過(guò)納米孔通道時(shí)，會(huì)引起不同電學(xué)信號(hào)的變化。通過(guò)對(duì)這些信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)及對(duì)應(yīng)，即可計(jì)算獲得相應(yīng)堿基的類型，完成序列的實(shí)時(shí)測(cè)定。

Nanopore的堿基判讀是依據(jù)其電流信號(hào)而產(chǎn)生，因此其判定過(guò)程比較復(fù)雜。目前Nanopore根據(jù)電流的大小及電流大小的變化情況，通過(guò)“遞歸神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（Recurrent Neural Network）”的復(fù)雜算法對(duì)堿基進(jìn)行判讀。

宏基因組是對(duì)環(huán)境樣本中（土壤、糞便、腸道、水體等）微生物總DNA進(jìn)行測(cè)序。關(guān)注環(huán)境微生物的種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化分析、功能基因；解析微生物功能與環(huán)境之間的關(guān)系；挖掘和研究特定功能基因及代謝通路。納米孔測(cè)序技術(shù)能夠?qū)Νh(huán)境樣本進(jìn)行√確的微生物組分析。并且已經(jīng)在宏基因組領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。

基于Nanopore測(cè)序平臺(tái)的宏基因組測(cè)序，通過(guò)生物信息分析獲得環(huán)境中的基因功能信息和物種組成信息。通過(guò)基因功能的角度分析環(huán)境樣品所具有的功能多樣性；通過(guò)物種的角度分析分析環(huán)境樣品中含有的物種的多樣性。

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

提高物種鑒定的精準(zhǔn)度

獲得低豐度物種

微生物更完整的基因組（無(wú)法分離培養(yǎng)菌）

獲得環(huán)境樣本中細(xì)菌基因組草圖（binning）

含義：分箱、聚類，指從微生物群體序列中將不同個(gè)體的序列（reads或contigs等）分離開(kāi)來(lái)的過(guò)程。

contig binning在常規(guī)宏基因組基礎(chǔ)上，進(jìn)一步將拼接的contig進(jìn)行cluster聚類，可實(shí)現(xiàn)單菌的組裝以及宏基因組關(guān)聯(lián)分析（MWAS）分析。

基于宏基因組數(shù)據(jù)的contig binning分析，可基于宏基因組組裝結(jié)果，將組成相似以及豐度分布模式一致的contig劃分到同一物種，并進(jìn)一步進(jìn)行單菌的草圖組裝。從而可在基于單菌組裝結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行菌株水平的基因和功能注釋、比較基因組分析、進(jìn)化分析等。

按照Oxford Nanopore Technologies(ONT)公司提供的標(biāo)準(zhǔn)protocol執(zhí)行，包括樣品質(zhì)量檢測(cè)、文庫(kù)構(gòu)建、文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)和文庫(kù)測(cè)序等流程，主要包括如下步驟：

1、提取高質(zhì)量基因組DNA，利用Nanodrop、Qubit和0.35%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純度、濃度和完整性質(zhì)檢；

2、BluePippin全自動(dòng)核酸回收系統(tǒng)回收大片段DNA；

3、文庫(kù)構(gòu)建（SQK-LSK109連接試劑盒）；

1) DNA損傷修復(fù)和末端修復(fù)，磁珠純化；

2) 接頭連接，磁珠純化；

3) Qubit文庫(kù)定量。

4、上機(jī)測(cè)序。

對(duì)測(cè)序得到的原始reads進(jìn)行質(zhì)量控制并過(guò)濾得到Clean reads，用于后續(xù)生物信息學(xué)的分析。對(duì)Clean reads進(jìn)行拼接組裝、預(yù)測(cè)編碼基因，并對(duì)編碼基因進(jìn)行通用數(shù)據(jù)庫(kù)和專用數(shù)據(jù)庫(kù)的功能注釋；同時(shí)，對(duì)Clean reads進(jìn)行分類學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)樣品物種組成和豐度信息。

物種注釋

使用diamond軟件將質(zhì)控后的高質(zhì)量測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到 nr數(shù)據(jù)庫(kù)，得到樣品的物種組成和相對(duì)豐度信息。

CARD功能基因組成分析

微生物基因功能注釋

將預(yù)測(cè)到的非冗余基因與Nr、GO、COG和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得基因功能注釋信息，了解環(huán)境中微生物潛在的生物學(xué)功能。

CAZy 數(shù)據(jù)庫(kù)功能注釋

差異基因功能富集分析