Identification of Genes Potentially Associated with the Fertility Instability of S-Type Cytoplasmic Male Sterility in Maize via Bulked Segregant RNA-Seq
發(fā)表雜志：PLOS ONE
發(fā)表日期：2016-9-26
合作單位：北京農林科學院
研究背景：
細胞質雄性不育（CMS，花粉不育但雌蕊能正常發(fā)育）是高等植物中的常見現象，表現為母系遺傳。CMS廣泛應用于作物雜交育種，以避免額外的人力物力去人工去雄，因此，CMS具有重要的理論和商業(yè)價值。植物CMS是由核線粒體相互作用介導的，不育性狀的產生來自線粒體基因的表達，但不育性狀可以通過核恢復育性基因得到恢復，產生育性部分恢復的表型。目前造成育性不穩(wěn)定的遺傳修飾的分子機制仍然不清楚。本研究欲通過BSR的策略尋找引起玉米育性不穩(wěn)定的候選基因。
材料選?。?/span>
Jing724和 MD32（CMS-S：S型細胞質雄性不育系）為親本，雜交得到F1群體，再以Jing724為回交親本，構建BC4群體，群體大小462。選取BC4群體中極端30個完全雄性不育植株的花粉，分別提取RNA，并等量混合構建不育池S，同理選取30個育性部分恢復植株的花粉，構建育性部分恢復池F。
測序平臺：Illumina HiseqTM2500，PE125
測序數據：150M clean reads
主要結果：
1、育性分析：FIL-B（育性不穩(wěn)定系）分為育性部分恢復的植株和完全不育植株，本項目所構建的BC4群體462個子代中有14.9% 的植株為育性部分恢復的表型。育性部分恢復植株的花粉大小小于正常花粉，大于完全不育植株的花粉（Fig 1.）。經I2-KI染色后的不育花粉表現出形態(tài)的不規(guī)則和染色的異常（Fig 2.）。
Fig 1. FIL-B花粉展示
A：Jing724 和FIL-B （育性不穩(wěn)定系，包括育性部分恢復植株和完全不育植株） 在抽穗6天后的穗；B： A圖中各植株穗上的花粉. 其中紅色的標尺代表 3 cm
Fig 2. I2-KI染色后的花粉
A: 正?；ǚ? B: 育性部分恢復花粉；C：不育花粉
2、顯微鏡下觀察花粉小孢子：在育性部分恢復的植株中只有一部分的小孢子呈現在正常形態(tài)，而在不育植株中無正常形態(tài)小孢子。（Fig 3.）
Fig 3. 花粉小孢子的顯微觀察
A: 正常花粉; B: 育性部分恢復花粉；C：不育花粉
3、混池間差異基因分析：本項目以B73為參考基因組，將F池和S池獲得的89M和61M clean reads進行比對。F池和S池的唯一比對效率為72.79% 和69.17%，表達的基因數目分別為31,905和31,895。獲得混池間的差異基因數目3,672個，在F池中上調表達的有3548個，下調表達的有124個，這些基因共3540個通過NR, Swiss-Prot, GO, COG和 KEGG數據庫得到注釋。
4、BSR關聯(lián)分析：與參考基因組比對后，F池和S池分別獲得171,594和 170,820個 SNP，選取混池間差異的SNP位點，進行ED關聯(lián)分析，共得到5個候選區(qū)域（Fig 4.），結合數據庫注釋結果及轉錄組差異基因的結果，最終獲得12個候選基因（Table 2、Table 3）。
Fig 4. ED關聯(lián)分析結果圖
A: 各染色體上SNP的ED值; B: 2號染色體上SNP的ED值；C：各染色體上SNP經擬合后的關聯(lián)分析結果；B: 2號染色體上SNP經擬合后的的關聯(lián)分析結果，其中紅色的虛線代表閾值線（99百分位法計算得到），黑色的實線代表擬合曲線
5、關聯(lián)基因的qPCR驗證：
本研究選取6個與蛋白相關的候選基因，通過qPCR的方法驗證RNA-seq結果。研究發(fā)現在育性部分恢復和不育兩種表型中，這6個候選基因出現4-8倍不同水平的差異表達。
Fig 5. qPCR驗證結果
6、KASP驗證：
本研究選取BC4群體中50株育性部分恢復植株和50株不育植株，分別提取DNA，對候選的兩個蛋白基因共4個SNP位點進行KASP驗證，發(fā)現在不同的表型下會出現不同的基因型，再次暗示這兩個基因很可能是與育性不穩(wěn)定相關。
Fig 6. KASP驗證結果
文章亮點：
1、研究性狀雄性不育在育種工作中具有重大意義，算得上熱點研究。
2、BSR定位結果準確：轉錄組BSR不僅能實現SNP水平的定位，同時能從基因的差異表達水平進一步縮小候選范圍，定位結果相對精細。
3、驗證內容豐富：從RNA水平（qPCR）和DNA水平（KASP）驗證，只為拿到候選基因。
參考文獻：
Su A, Song W, Xing J, et al. Identification of Genes Potentially Associated with the Fertility Instability of S-Type Cytoplasmic Male Sterility in Maize via Bulked Segregant RNA-Seq[J]. PloS one, 2016, 11(9): e0163489.
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