Circulation 單細(xì)胞測序提供心肌梗死治療新方向

導(dǎo)讀：
單細(xì)胞測序技術(shù)自2009年問世以來多次被Nature、Science、Nature Method等學(xué)術(shù)期刊評價為年度重點技術(shù)，因為單細(xì)胞技術(shù)可以彌補(bǔ)混合測序籠統(tǒng)地對腫瘤組織和微環(huán)境細(xì)胞進(jìn)行基因分析（bulk phase sequencing）等缺陷，能夠√確到單細(xì)胞水平，是生命科學(xué)領(lǐng)域研究一大利器。但在2015年以前并沒有得到廣泛應(yīng)用，源于技術(shù)無法做到高通量檢測、成本較高。隨著技術(shù)的發(fā)展和革新，F(xiàn)luidigm公司的C1平臺、BD公司的Rhapsody平臺以及10x Genomics平臺等技術(shù)的出現(xiàn)，特別是2016年10x Genomics商業(yè)化平臺橫空出世，徹底降低了單細(xì)胞測序的成本門檻，使得單細(xì)胞測序技術(shù)能被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科研和臨床研究，特別是對于癌癥早期的診斷、追蹤以及個體化治療具有重要意義，引領(lǐng)新一輪生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)革命。

這里小編特地檢索了目前關(guān)于單細(xì)胞RNA測序的文章發(fā)表情況，結(jié)果總計達(dá)到4300+篇，可見單細(xì)胞測序技術(shù)被廣泛使用，特別是2016年以后文章呈井噴式增長，涉及的領(lǐng)域包括胚胎生長發(fā)育、腫瘤微環(huán)境研究、干細(xì)胞分化、疾病藥物靶點耐藥機(jī)制、組織細(xì)胞免疫反應(yīng)、神經(jīng)學(xué)科腦損傷等多方面，幾乎可以在所有的生物科學(xué)領(lǐng)域利用單細(xì)胞測序技術(shù)在單細(xì)胞水平研究生命機(jī)理。說了那么多，我們來聊聊單細(xì)胞技術(shù)研究成果吧！
Circulation（IF=23.603）刊登了單細(xì)胞RNA測序揭示心肌成纖維細(xì)胞（CF）亞群表達(dá)特征在心肌梗死中的關(guān)鍵作用一文。該文章正是應(yīng)用scRNA-seq技術(shù)檢測了帶有Col1α1-GFP標(biāo)記的小鼠，結(jié)果顯示了CF的異質(zhì)性并鑒定了新的CF亞群RCF，主要負(fù)責(zé)心臟損傷后愈合反應(yīng)，同時找到了心肌梗死后該細(xì)胞亞群中一個參與心室重塑過程的關(guān)鍵分子Cthrc1，表明新的細(xì)胞亞群參與心肌纖維化過程，并且Cthrc1可以調(diào)控該過程從而為心臟相關(guān)疾病提供新的治療途徑。

【英文題目】Single-Cell RNA-seq Analysis Reveals a Crucial Role for Collagen Triple Helix Repeat Containing 1 (CTHRC1) Cardiac Fibroblasts after Myocardial Infarction
【中文題目】單細(xì)胞RNA測序揭示心肌梗死后CTHRC1在心肌成纖維細(xì)胞中的關(guān)鍵作用
【發(fā)表期刊】Circulation
【影響因子】23.603
【發(fā)表時間】2020.09.25
【DOI】10.1161/CIRCULATIONAHA.119.044557

研究背景

心肌成纖維細(xì)胞(CF)在與不同類型的纖維化相關(guān)的心室重構(gòu)過程中發(fā)揮核心作用。研究表明，成纖維細(xì)胞對心臟損傷的反應(yīng)并不均勻。由于真實成纖維細(xì)胞標(biāo)記物是有限的，成纖維細(xì)胞群體異質(zhì)性對心臟損傷的反應(yīng)仍缺乏恰當(dāng)?shù)谋碚?。本研究的目的是確定心室重構(gòu)過程中CF的異質(zhì)性以及調(diào)節(jié)其功能的潛在機(jī)制。

材料與方法

材料：7079個正常的CF；10,448 個7dpi；8,337個14dpi;6,805個30dpi；
方法：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）、ATAC-seq、RNA-seq

研究結(jié)果

1.單細(xì)胞測序表征心肌成纖維細(xì)胞異質(zhì)性圖譜
為了跟蹤心肌梗死（MI）過程中CF群體細(xì)胞的動態(tài)變化，文章使用Col1α1-GFP標(biāo)記的小鼠，通過熒光定位和流式細(xì)胞分選檢測出CF具有GFP + /CD31 – /CD45 – 表型，并且心肌梗死后GFP + 細(xì)胞在梗死區(qū)(IZ)和邊緣區(qū)(BZ)百分比和總數(shù)都增加了，顯然GFP + /CD31 – /CD45 – 的細(xì)胞表達(dá)與經(jīng)典的CF轉(zhuǎn)錄組譜一致，表明心臟的GFP +細(xì)胞是真正的成纖維細(xì)胞，驗證了Col1α1-GFP模型小鼠可用于研究心臟修復(fù)過程中的CF生物學(xué)。
為了進(jìn)一步表征心肌成纖維細(xì)胞在單細(xì)胞水平心肌梗死后的動態(tài)變化，本文分選出GFP + CF作為單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析研究對象，利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序一共檢測了29,176個細(xì)胞，通過轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析鑒定了10個心肌成纖維細(xì)胞亞群（A-J簇），其中K簇是一個經(jīng)典的周皮細(xì)胞標(biāo)記物高表達(dá)群體，B，D，I和J簇顯示特定的表達(dá)譜，代表潛在的功能CF亞群，而其余簇（A，C，E，F(xiàn)，G和H）顯示出較少的轉(zhuǎn)錄組特征，很可能是反映較大人群中的中間CF類型。同時與近期CF 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)相比較，GFP+ CF都在證實CF范圍內(nèi)。

圖1. scRNA-seq揭示心肌成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性

2. 新CF亞群的鑒定-RCF

為了進(jìn)一步探尋不同簇在MI過程中的潛在作用，作者通過分析不同簇細(xì)胞百分比的變化，發(fā)現(xiàn)F、H和K簇細(xì)胞百分比在不同時間點保持不變，而B簇在MI前后GFP+細(xì)胞百分比出現(xiàn)了明顯的變化，在健康的心肌中只有2.3%的GFP+細(xì)胞屬于B簇，MI后百分比急劇上升(7dpi為12%，14dpi為34%)，隨后在30dpi下降到12%。通過KEGG和GO功能預(yù)測富集分析，與其他簇相比發(fā)現(xiàn)B簇轉(zhuǎn)錄組基因顯著性富集在細(xì)胞外基質(zhì)組織、細(xì)胞增殖、細(xì)胞基質(zhì)粘附相關(guān)信號通路中，明顯B簇細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組涉及到結(jié)構(gòu)性（Fmod、Comp）和膠原代謝(Ddah1、Lox、Ptn)相關(guān)的基因，而且通過鑒定發(fā)現(xiàn)Cthrc1可以作為B簇*顯著性標(biāo)志性分子，該基因主要參與血管重構(gòu)和纖維化過程，并且B簇ECM相關(guān)基因高度特異性表達(dá)，表明B簇與纖維化過程密切相關(guān)。免疫組化分析B簇標(biāo)志物分子Cthrc1, Ddah1和Fmod在7,14,30dpi的IZ和BZ區(qū)域都存在，同時利用RNAseq表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)心肌梗死7dpi也存在B簇的表達(dá)特征。通過以上實驗，作者定義B簇為CF一個亞群，其特征有：1）在MI過程中出現(xiàn)；2）呈現(xiàn)顯著的動態(tài)纖維化；3）定位在受損的組織中。通過擬時序分析發(fā)現(xiàn)Cthrc1幾乎只在B簇細(xì)胞中表達(dá)，而其他的一些活化CF標(biāo)記基因如Postn、 Acta2/αSMA在激活的早期階段表達(dá)，這也就預(yù)示著B簇成纖維細(xì)胞是MI反應(yīng)中產(chǎn)生的Postn + CF亞群的最終激活階段。

為了確定B簇細(xì)胞和其他活化的CF亞群之間的差異，作者比較了特異性表達(dá)Postn(活化的CF)、Acta2 (基質(zhì)纖維細(xì)胞)和/或Cthrc1 (B簇成纖維細(xì)胞)的CF的轉(zhuǎn)錄組譜。根據(jù)這三種標(biāo)記的聯(lián)合表達(dá)，會出現(xiàn)不同的活化CF亞群?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明B簇細(xì)胞代表了一個特定的活化的Postn + CF亞群，在修復(fù)心臟纖維化過程中起主要作用。因此,作者將這些細(xì)胞亞群定義為修復(fù)心肌成纖維細(xì)胞(RCF)。

圖2. 新CF細(xì)胞亞群的鑒定

3. RCF形成的分子調(diào)控機(jī)制的探索
文中采用經(jīng)典的聯(lián)合組學(xué)方法研究RCF形成的分子機(jī)制。首先通過ChiP-seq數(shù)據(jù)挖掘RCF相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)SOX9能與多個RCF標(biāo)志分子結(jié)合，而且SOX9過表達(dá)能夠誘導(dǎo)CF產(chǎn)生23%的RCF，這表明了SOX9可以參與CF的激活并促進(jìn)RCF的形成。為了進(jìn)一步證實TF調(diào)控RCF的形成，作者利用ATAC-seq檢測了處于7dpi時的CD200 + /CD146 -（RCF）和CD200 – /CD146 以及不同時期 的GFP + CF，結(jié)果表明RCF具有*高的染色質(zhì)可及性。Motif分析進(jìn)一步表明RUNX1、SMAD等可作為RCF的調(diào)節(jié)因子，通過差異分析表征了調(diào)節(jié)RCF形成的三類特征TF；同時構(gòu)建蛋白信號傳導(dǎo)和基因調(diào)控互作網(wǎng)絡(luò)圖分析顯示RCF相關(guān)基因的表達(dá)是通過非典型的TGF-β1/PI3K-Akt信號通路驅(qū)動的。而TGF-β1特異性抑制劑SMAD2/3和非特異性抑制劑AKT 、 p38都減少了ECM（Col1α1, Col3α1, Lox）和CF激活相關(guān)基因(Cthrc1, Ddah1, Postn, Acta2)的表達(dá)。這些結(jié)果表明，RCF的纖維化激活和表型轉(zhuǎn)化受SMAD2/3和AKT/p38的平衡調(diào)控。值得注意的是，TGF-受體1/ALK5 的特異性抑制劑SB -43154只調(diào)控Acta2和Col1α1，但不調(diào)節(jié)Postn和Col3α1。

圖3.RCF形成分子調(diào)控機(jī)制

4. CTHRC1調(diào)節(jié)RCF損傷愈合修復(fù)的活性

作者觀察到Cthrc1只在CF中而不在其他心肌細(xì)胞中表達(dá)，因此想要探討Cthrc1在CF中的功能作用。文中通過Cthrc1敲除小鼠（KO）研究發(fā)現(xiàn)在生長發(fā)育成年過程中大小、體積、心臟表型都沒有太大的變化，但是心肌梗死后KO小鼠的存活率顯著下降（80% WT vs 30% KO），這與KO梗塞心臟左心室游離壁膠原沉積的顯著減少有關(guān)。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，與WT相比較，KO CF在MI 涉及到細(xì)胞分化、增殖以及蛋白合成信號通路富集有顯著性差異，并且通過TGF-β1誘導(dǎo)的KO CF在血管生成、肌肉收縮、血管系統(tǒng)發(fā)育等相關(guān)通路基因明顯下調(diào)，表明KO CF對TGF-β1反應(yīng)調(diào)控能力降低。單細(xì)胞RNA測序進(jìn)一步分析了4189個處于7dpi的KO CF，與WT相比較，RCF類的細(xì)胞百分比增加了（21% KO vs 14 WT）。RCF類的CF和其他活化CF的亞群（如POSTN +）都在Cthrc1-KO梗死小鼠的IZ和BZ中被發(fā)現(xiàn)了，這也就說明了心室破裂的表型來源于CTHRC1 的缺失。因此，Cthrc1的缺失與ECM組織、膠原生物合成和TGF-介導(dǎo)的調(diào)控有關(guān)的基因下調(diào)密切相關(guān)。這也證實了RCF通過分泌CTHRC1介導(dǎo)心臟修復(fù)影響ECM分子的沉積和合成，促進(jìn)CF的增殖。

圖4. CTHRC1是RCF在愈合修復(fù)過程中的重要效應(yīng)因子

5. 臨床RCF表達(dá)特征圖譜驗證

為了進(jìn)一步評估RCF細(xì)胞群的表達(dá)特征圖譜，分別在臨床模型豬和人心肌成纖維組織中進(jìn)行驗證，均表明可以在MI過程中檢測到RCF，并且CTHRC1 表達(dá)的細(xì)胞只存在心肌梗死區(qū)（IZ）。最后，在缺血性心肌病患者的缺血區(qū)(IZ)和擴(kuò)張型心肌病(DCM)患者的左右心室活檢中，部分發(fā)現(xiàn)了RCF的轉(zhuǎn)錄特征。與對照組相比，RCF轉(zhuǎn)錄組特征的幾個基因(CTHRC1、PTM、FMOD)在本研究的所有病理條件下均顯著過表達(dá)。此外，CTHRC1 + CF在患者梗死心臟的IZ中發(fā)現(xiàn)，而在RZ中沒有發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了CTHRC1 + RCF在指揮心臟纖維化患者心臟修復(fù)過程中的潛在作用。

圖5. RCF標(biāo)志物的表達(dá)在心肌梗死模型豬和人中的驗證

總結(jié)

綜上所述，本文巧妙地利用了scRNA-seq、RNA-seq以及ATAC多組學(xué)聯(lián)合技術(shù)，表征大量的CF細(xì)胞亞群，揭示了在MI后CF的顯著異質(zhì)性，并定義了一個具體以Cthrc1表達(dá)為特征的亞群-RCF；充分表明了Cthrc1+ CF在心肌梗死后早期愈合過程中的作用，這些新發(fā)現(xiàn)為患者心臟纖維化過程進(jìn)行治療提供了新方向。