?近年來，單細(xì)胞組學(xué)領(lǐng)域發(fā)展非常迅速，廣泛應(yīng)用于人類和動物的研究中，為人們研究細(xì)胞異質(zhì)性以及微生物群落的生態(tài)多樣性提供了新的視角。在植物中，由于細(xì)胞壁的存在，大大阻礙了單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）的應(yīng)用，雖然原生質(zhì)體已用于scRNA-seq分析，但僅僅限于適合消化細(xì)胞壁的組織。許多細(xì)胞類型在原生質(zhì)體制備過程中可能出現(xiàn)基因異位表達(dá)或細(xì)胞類型偏好等問題。隨著scRNA-seq技術(shù)的發(fā)展，單細(xì)胞核RNA測序（snRNA-seq）讓植物單細(xì)胞測序不再受制于制備原生質(zhì)體，能夠更好的解決傳統(tǒng)研究中存在的細(xì)胞異質(zhì)性的問題，為研究者們提供更多選擇。
本文介紹的是利用snRNA-seq技術(shù)，解密番茄莖尖的發(fā)育軌跡，在這里，本文展示了一種用于高通量單核RNA測序（snRNA-Seq）的方法，該方法可用于分析番茄莖尖細(xì)胞。
獲得的高分辨率表達(dá)圖鑒定了主要的莖尖組織和發(fā)育階段的不同細(xì)胞類型，描繪了葉肉細(xì)胞，脈管系統(tǒng)細(xì)胞，表皮細(xì)胞和毛狀體細(xì)胞的發(fā)育軌跡。這項研究證明了snRNA-seq在植物研究中的作用，并為異質(zhì)莖尖細(xì)胞提供了時空基因表達(dá)圖譜。該文章已發(fā)表在預(yù)印本雜志BioRxiov上。
文章題目：Single-nucleus RNA-seq resolves spatiotemporal developmental trajectories in the tomato shoot apex
細(xì)胞核提取方法
材料預(yù)處理：在解剖顯微鏡下對番茄莖尖進(jìn)行解剖，保留了2周齡植株的莖尖分生組織區(qū)和早期葉原基，葉原基到P3(第三片葉的葉原基）。
細(xì)胞核提取方法：將冷凍番茄莖尖分生組織重懸于10ml含0.1%蛋白酶抑制劑的核分離液（NIB：10 mM MES-KOH（pH = 5.4），10 mM NaCl，10 mM KCl，2.5 mM EDTA，250 mM蔗糖，0.1 mM精胺，0.5 mM亞精胺，1 mM DTT）中，在冰上使用勻漿器低速勻漿，冰上裂解30分鐘后，將勻漿物在三層尼龍網(wǎng)中過濾兩次。同時為了消除葉綠體，將10％Triton X-100滴加到溶液中，使其最終濃度為0.1％（v / v），直到大多數(shù)葉綠體降解為止。然后將核懸浮液以1000 g離心5分鐘。將沉淀的核洗滌兩次，然后將其懸浮在NIB中。通過臺盼藍(lán)染色確定細(xì)胞核的質(zhì)量和濃度，并在顯微鏡下計數(shù)。
結(jié)果
1.原生質(zhì)體引起異位基因表達(dá)
莖尖分生組織和早期葉片原基具有復(fù)雜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)由嵌入不同組成的細(xì)胞壁中的異質(zhì)細(xì)胞組成。制備原生質(zhì)體，需要長時間的酶消化。異位激活和隨機(jī)基因的表達(dá)與原生質(zhì)體形成相關(guān)。為了評估原生質(zhì)體對基因表達(dá)的影響，本文檢測擬南芥葉片和葉肉原生質(zhì)體中的基因表達(dá)，并觀察到頻繁的異位激活。例如，WOX2未在葉子中表達(dá)（圖1a）。追蹤了10,000多個原生質(zhì)體，觀察到超過21％的原生質(zhì)體表達(dá)了WOX2（圖1b）。該觀察結(jié)果強(qiáng)烈暗示通過原生質(zhì)體化存在基因表達(dá)的異位隨機(jī)激活。
圖1葉片和原生質(zhì)體中WOX2的表達(dá)模式
2.snRNA-seq鑒定了番茄莖尖的主要細(xì)胞類型
根據(jù)本文細(xì)胞核提取的方法，得到正常形態(tài)的番茄莖尖分生組織的細(xì)胞核，進(jìn)行snRNA-seq。（圖2a）。經(jīng)過質(zhì)量控制和過濾，獲得了13377個核，檢測到基因數(shù)為21402。為了評估snRNA-seq數(shù)據(jù)的可重復(fù)性和敏感性，本文用番茄莖尖進(jìn)行Bulk RNA-seq。snRNA-seq檢測到的基因，有92.3%可以通過Bulk RNA-seq檢測到（FPKM > 1），表明snRNA-seq具有較高的敏感性，snRNA-seq和Bulk RNA-seq的相關(guān)性達(dá)到0.9（圖2b），表明具有很高的重現(xiàn)性。
圖2 snRNA-seq繪制番茄莖尖細(xì)胞圖譜
為了鑒定不同的細(xì)胞類型，本文采用無監(jiān)督聚類分析。采用t-SNE算法，將細(xì)胞核分組為16個clusters(圖2c)。每個cluster具有顯著差異的基因表達(dá)模式。鑒定了每個cluster的一系列特異性標(biāo)記基因(圖3a)。為了注釋這些clusters，本文將cluster的marker基因與已知的marker基因進(jìn)行了關(guān)聯(lián)。此外，本文還與擬南芥富集于相應(yīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)域的同源基因相關(guān)聯(lián)。本文發(fā)現(xiàn)在幾個clusters中，顯著富集到擬南芥細(xì)胞域特異性的同源基因，這些結(jié)構(gòu)域包括表皮，葉肉和脈管系統(tǒng)域（圖4）。此外，在擬南芥分生組織中廣泛表達(dá)的marker基因SlSTM和SlBP在clusters 0、3、4、5、6、7中特異性表達(dá)，由此得出，本文的樣本中有相當(dāng)一部分與莖尖分生組織相對應(yīng)?；谝陨闲畔ⅲ瑢lusters分為4個cluster clouds，分別對應(yīng)于番茄的表皮和毛狀體（clusters 2、7、9、10和16），葉肉（clusters 1、12和14），脈管系統(tǒng)（clusters 4、11和15）和分生組織細(xì)胞（clusters 0、3、5、6、8和13）（圖2c，d）。
總之，本文鑒定了莖尖的主要的細(xì)胞類型，提供了莖尖細(xì)胞空間分布的基因表達(dá)信息（圖3b,d）.
圖3 marker 基因的表達(dá)模式和細(xì)胞空間分布
圖4 細(xì)胞類型特異性基因的富集分析
3.番茄莖尖細(xì)胞軌跡分析
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以捕獲具有過渡狀態(tài)的細(xì)胞，從而使本文能夠追蹤特定細(xì)胞類型的發(fā)育軌跡。為了獲得莖尖細(xì)胞發(fā)育軌跡圖，本文用uMAP算法分析clusters聚類和等級結(jié)構(gòu)（圖3c），鑒定出相似的clusters，對應(yīng)分生組織細(xì)胞的clusters位于中心。起源于分生組織細(xì)胞的莖尖細(xì)胞連續(xù)分化形成表皮細(xì)胞，毛狀體細(xì)胞，葉肉細(xì)胞和脈管系統(tǒng)細(xì)胞。
根據(jù)細(xì)胞軌跡分析，在莖尖分生組織的外圍區(qū)域處葉片開始萌發(fā)，葉肉細(xì)胞分化，伴有脈管系統(tǒng)的形成。細(xì)胞發(fā)育軌跡起始于分生組織細(xì)胞（cluster 3），葉肉細(xì)胞（clusters 1和12）與脈管系統(tǒng)細(xì)胞（clusters 4,11和15）明顯分離，隨后，脈管系統(tǒng)細(xì)胞分離為木質(zhì)部細(xì)胞和韌皮部細(xì)胞（圖5a，b）
圖5 葉肉細(xì)胞和脈管系統(tǒng)的發(fā)育軌跡
結(jié)論
細(xì)胞壁的存在極大阻礙了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)在植物研究中的應(yīng)用。在這項研究中，本文開發(fā)了一種處理組織的方法，可對幾乎任何植物細(xì)胞類型進(jìn)行snRNA-seq分析。此外，snRNA-seq有望減輕與原生質(zhì)體形成相關(guān)的異位基因表達(dá)變化。本文用snRNA-seq已獲得番茄莖的高分辨率細(xì)胞表達(dá)圖譜，可識別大多數(shù)已知的細(xì)胞類型，并在細(xì)胞和分子水平上表現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性。綜上所述，本文提供了一個強(qiáng)大的單核轉(zhuǎn)錄組分析流程，可以廣泛應(yīng)用于其他物種和組織，并為研究干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和早期器官發(fā)生提供了寶貴的資源。
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