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發(fā)布于 2021年9月3日

2021年8月，國內(nèi)第一篇基于10x Genomics單細胞聯(lián)合10× Visium 空間轉(zhuǎn)錄組的文章在《Cell Research》見刊！文章作者來自中國科學(xué)院動物研究所的劉峰老師課題組和北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的李程老師課題組，利用scRNA-seq和ST技術(shù)構(gòu)建小鼠胎肝（FL）的時空轉(zhuǎn)錄組圖譜，揭示HSCs/MPPs的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性，進一步解析造血干細胞和多能祖細胞（HSC/MPP）在其固有生態(tài)位擴增的細胞和分子機制。

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實驗材料

將雄性CD45.1小鼠與雌性CD45.2小鼠雜交獲得小鼠胚胎；終止妊娠后獲得的人類胚胎；健康志愿者處收集人類臍帶血 (CB) 樣本

ScRNA-seq樣本：經(jīng)FACS分選FL四個時間點（E11.5，E12.5，E13.5，和 E14.5）的細胞，包括造血細胞（HC）、內(nèi)皮細胞（EC）和非造血/費內(nèi)皮細胞（NC），之后混合測序。

ST樣本：使用來自 E14.5 胚胎沿背腹軸的四個切片進行了 10× Visium ST，重點放在 FL 區(qū)域。

實驗方法

免疫熒光，菌落形成單位(CFU)培養(yǎng)試驗，移植試驗，蛋白免疫印跡（WB），scRNA-seq，10× Visium ST，小鼠和人之間FL的跨物種分析

文章思路圖

研究背景

在哺乳動物中，造血干細胞和多能祖細胞 (HSCs/MPPs) 占據(jù)造血系統(tǒng)層次結(jié)構(gòu)的頂端，表現(xiàn)出多向分化和自我更新的能力。HSC/MPP 擴增的研究為再生醫(yī)學(xué)帶來了巨大希望，并且科學(xué)家們已經(jīng)做出了重大努力，通過基因工程或優(yōu)化培養(yǎng)條件來實現(xiàn)長期的HSC/MPP離體擴增。然而，在目前的HSC/MPP離體擴增培養(yǎng)中，挑戰(zhàn)的關(guān)鍵是如何保持干細胞的特性；因此，需要全面了解 HSC/MPP 在體內(nèi)固有生態(tài)位中的擴增。高度血管化的胎肝 (FL) 是各種來源的造血細胞 (HC)的臨時發(fā)育部位。研究證明在小鼠中，F(xiàn)L結(jié)構(gòu)生態(tài)位細胞包括內(nèi)皮細胞（EC）、基質(zhì)細胞和成肝細胞，并通過多樣化的生長因子、細胞因子和趨化因子與HSC/MPP相互作用。HSC/MPP 和不同生態(tài)位細胞之間復(fù)雜的相互作用的潛在機制，以及 HSC/MPP 擴增的系統(tǒng)性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍然難以捉摸。

結(jié)果討論

一、發(fā)育中小鼠 FL 的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

基于10× Genomics，構(gòu)建E11.5，E12.5，E13.5和 E14.5 FL 的單細胞分辨率細胞圖譜，共計包含有32449個單細胞，分為了21個細胞簇，包括 18 個 HC 簇和 3 個結(jié)構(gòu)生態(tài)位細胞簇，并發(fā)現(xiàn)它們的比例與發(fā)育階段動態(tài)相關(guān)。四個時間點的差異基因的GO 分析顯示有絲分裂細胞周期調(diào)節(jié)和細胞生長也富含不同類型的結(jié)構(gòu)生態(tài)位細胞，表明細胞數(shù)量和大小的整體增加用以適應(yīng) FL 擴張。

圖1 發(fā)育中小鼠 FL 的單細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

a FL組織的scRNA-seq 實驗流程示意圖。b FL中所有單細胞的UMAP可視化。c熱圖顯示每個細胞簇前20個DEGs的表達模式。d在 FL 發(fā)育過程中，HSC/MPP 中富集的 GO通路。e FL發(fā)育過程中 HSC/MPP 中富集的 DEGs的散點圖。

二、富含 CD93 的 HSCs/MPPs 表現(xiàn)出增強的干細胞特性

GO 和 DEG 分析表明 HSC/MPP1-3 中造血調(diào)節(jié)和分化、主動翻譯過程和細胞周期調(diào)節(jié)等通路富集。HSC/MPP亞群和下游髓系淋巴祖細胞之間的軌跡分析顯示 HSC/MPP1 占據(jù)造血系統(tǒng)層級的頂部。總體而言，這些結(jié)果表明，與 HSC/MPP2-3 相比，HSC/MPP1 表現(xiàn)出最強大的干細胞轉(zhuǎn)錄組特征。

圖2 富含CD93 的 HSC/MPP 表現(xiàn)出增強的干細胞特性

a HSC/MPP三個亞群的GO富集分析。b三種HSC/MPP亞型中富集的DEG的散點圖。c HSC/MPP1與HSC/MPP2（左）與 HSC/MPP3（右）中所有基因表達的散點圖。d箱線圖顯示了三種 HSC/MPP 亞型的 hscScore 分布。e軌跡分析重建HSC/MPP 到淋巴和骨髓祖細胞的譜系分化。f熱圖顯示了三種 HSC/MPP 亞型中HSC/MPP 特征基因和Cd93的表達模式。g使用 CD93 + SLAM-LSK (CD93 + HSC) 和 CD93 – HSC進行初次移植后 8 周受者外周血 (PB) 中供體來源的嵌合體比例。h使用 CD93 + HSC 和 CD93 – HSC進行初次移植后 20 周時受者 PB 中供體來源的嵌合體比例。i在使用 CD93 + HSC 和 CD93 – HSC進行二次移植后 8 周時受者 PB 中的供體來源嵌合體比例。j使用 CD93 + HSC 和 CD93 – HSC進行二次移植后 16 周時受者 PB 中供體來源的嵌合體比例。

三、 HSC/MPP 和生態(tài)位細胞之間的細胞-細胞相互作用

利用單細胞數(shù)據(jù)構(gòu)建了一個無偏的 HSC/MPP-生態(tài)位細胞相互作用網(wǎng)絡(luò)，重點是結(jié)構(gòu)生態(tài)位細胞和巨噬細胞。深入分析確定了參與 HSC/MPP 發(fā)展的幾種眾所周知的配體-受體相互作用，例如 TGFΒ1-TGFΒR1、TEK-ANGPT1 和 IGF2-IGF1R。通過反卷積分析發(fā)現(xiàn)紅細胞和成肝細胞在大多數(shù)斑點中顯示出最高的富集分數(shù)，表明它們是 FL 的主要細胞成分。總之，ST 描繪了 FL 的空間組織結(jié)構(gòu)，用以進一步解讀 scRNA-seq 預(yù)測的細胞-細胞相互作用。

圖3 HSCs/MPPs 和小生境細胞之間的細胞間相互作用

a示意圖展示 HSC/MPP 和生態(tài)位細胞（內(nèi)皮細胞、基質(zhì)細胞、成肝細胞和巨噬細胞）之間的細胞相互作用。b CellPhoneDB 分析展示主要的 HSC/MPP-生態(tài)位細胞相互作用對。c主要的HSC/MPP-生態(tài)位細胞相互作用對的配體（頂部）和相應(yīng)受體（底部）表達模式的散點圖。d 10×Visium ST 實驗流程示意圖。e E14.5 胚胎組織切片的蘇木精和伊紅 (HE) 染色。f組織切片中成肝細胞標(biāo)記物Afp 的表達模式。g熱圖展示了FL斑點的富集分數(shù)。h FL部分空間特征圖。

四、 HSC/MPP 擴增單位的識別

對于每種生態(tài)位細胞類型，不同類型斑點的富集得分分析表明，點內(nèi)得分最高的 EC 接近 HSC/MPP。發(fā)現(xiàn)巨噬細胞在點內(nèi)富集 11.52 倍，在點間富集 1.31 倍，EC 在點內(nèi)富集 1.62 倍，而肝母細胞和基質(zhì)細胞在點內(nèi)富集較少。總之，數(shù)據(jù)結(jié)果支持巨噬細胞是與 HSCs/MPPs 關(guān)系最密切的重要生態(tài)位細胞。通過分析預(yù)測的交互信號的空間表達，發(fā)現(xiàn)編碼配體的基因，如 MDK 和 PTN，在點內(nèi)和點間的生態(tài)位細胞中高度表達；并且與受體相關(guān)的基因，如 LRP1 和 PTPRS，在HSCs/MPPs 定位點富集。該結(jié)果證明 FL的 HSCs/MPPs 以多個單位擴增，其中巨噬細胞和多種生長因子（包括 MDK 和 PTN）高度富集。

圖4 HSC/MPP擴增單元識別

a點內(nèi)、點間及其他的示意圖。點內(nèi)：HSC/MPP 定位點；點間：HSC/MPP 包圍點；其他，其他遠端的點。b箱線圖展示點內(nèi)、點間和其他點中生態(tài)位細胞的富集分數(shù)。c箱線圖展示了點內(nèi)生態(tài)位細胞的歸一化（富集）評分。d箱線圖顯示點間生態(tài)位細胞的歸一化（富集）評分。e FL中Ptn和Ptprs 的共表達模式。f 空間特征圖展示Ptn-Ptprs豐富的 HSC/MPP 擴增單元?；騊tn在生態(tài)位細胞定位點（頂部，紅色點）和基因Ptprs在HSC/MPP 定位點（頂部，藍色點）的表達模式。g FL中Mdk和Lrp1 的共表達模式。h富含Mdk -Lrp1 的HSC/MPP 擴增單元（點間）的空間特征圖。i空間特征圖展示富含Mdk- Lrp1 的HSC/MPP 擴增單元（點內(nèi)）。

五、生態(tài)位細胞在促進 HSC/MPP 擴增中的作用的功能驗證

免疫熒光分析揭示巨噬細胞可以通過形成“口袋狀”結(jié)構(gòu)來促進 HSC/MPP 擴增，同時通過分泌 MDK 因子促進 HSC/MPP 擴增。10×Visium ST 結(jié)果說明了 HSCs/MPPs 和 ECs 之間更密切的空間關(guān)系，免疫熒光分析驗證了HSCs/MPPs 被 ECs 包圍。從功能上確定源自結(jié)構(gòu)生態(tài)位細胞的預(yù)測交互信號可以調(diào)節(jié) HSCs/MPPs 擴增。功能分析驗證了潛在的細胞間相互作用和支持 HSC/MPP 擴增的潛在分子機制。

圖5 巨噬細胞促進 HSC/MPP 擴增

a免疫熒光分析顯示 E14.5 FL 冷凍切片中 F4/80（代表巨噬細胞）和 c-Kit（代表 HSCs/MPPs）的表達。b免疫熒光分析顯示 E14.5 FL 冷凍切片中 F4/80（代表巨噬細胞）和 Runx1（代表 HSCs/MPPs）的表達。C柱狀圖展示有和無細胞相互作用的 HSCs/MPPs 的比例。d免疫熒光分析顯示 E14.5 FL 冷凍切片中 F4/80（代表巨噬細胞）、CD150（代表 HSCs/MPPs）、Mecom（代表 HSCs/MPPs）和 Hlf（代表 HSCs/MPPs）的表達。f源自巨噬細胞和 HSC/MPP 共培養(yǎng)系統(tǒng)的 HSCs/MPPs（LSK 細胞）的數(shù)量。g源自MDK補充培養(yǎng)物的 100 個 HSCs/MPPs（LSK、Flt3 -LSK 和 SLAM-LSK 細胞）的HSCs/MPPs（LSK 細胞）的數(shù)量。h氯膦酸鹽-脂質(zhì)體和對照-脂質(zhì)體處理后 E14.5 FL 中的總細胞數(shù)。i氯膦酸鹽處理前后 E14.5 FL中譜系- (Lin- ) 細胞的比例。j氯膦酸鹽處理前后 E14.5 FL 中 LSK 細胞的比例。k氯膦酸鹽處理前后 E14.5 FL 中 SLAM-LSK 細胞的比例。l流式細胞儀分析顯示E14.5 FL在氯膦酸鹽處理前后Lin -，LSK，SLAM-LSK的細胞比例。

圖6 促進 HSCs/MPPs 擴增的結(jié)構(gòu)生態(tài)位細胞

a 免疫熒光分析顯示了在 E14.5 FL 冷凍切片中 Lyve1（代表ECs）和 Runx1（代表 HSCs/MPPs）的表達。b免疫熒光分析顯示了 E14.5 FL 冷凍切片中 Lyve1（代表EC）和 Runx1（代表 HSCs/MPPs）的表達。c免疫熒光分析顯示 E14.5 FL 冷凍切片中 c-Kit（代表 HSCs/MPPs）、Runx1（代表 HSCs/MPPs）和 EphrinB2（代表動脈門脈血管）的表達。d免疫熒光分析顯示 c-Kit（代表 HSCs/MPPs）、Runx1（代表 HSCs/MPPs）和 EphB4（代表靜脈）在 E14.5 FL 冷凍切片中的表達。e Igfbp1、Igfbp5和Igfbp7在三種結(jié)構(gòu)生態(tài)位細胞（內(nèi)皮細胞、基質(zhì)細胞和成肝細胞）中的表達模式散點圖。f來自 E14.5 FL 的 100 個 SLAM-LSK 細胞因子培養(yǎng)物的 HSCs/MPPs（LSK 細胞）的數(shù)量。g來自 E14.5 FL的 100 個Flt3-LSK 細胞因子培養(yǎng)物的 HSCs/MPPs（LSK 細胞）的數(shù)量。h來自 E14.5 FL 的 100 個 LSK 細胞因子培養(yǎng)物的 HSCs/MPPs（LSK 細胞）的數(shù)量。

六、小鼠和人類FL造血功能的跨物種分析

本文數(shù)據(jù)揭示了小鼠和人類 FL 之間保守的細胞類型和造血分化途徑，說明人類和小鼠之間保留了許多 FL HSC 擴增機制，但 HSCs/MPPs 中也存在物種特異性轉(zhuǎn)錄組特征。

圖7 小鼠和人類FL造血的跨物種分析

a E14.5 FL中所有細胞類型的UMAP 可視化。b來自小鼠（E14.5）和人類（受孕后 11 周）的 FL 細胞群的 UMAP 可視化。c對人類 HSCs/MPPs中top DEG 進行 GO 生物過程相關(guān)的通路富集分析。d對小鼠 HSCs/MPPs 中top DEG進行GO生物過程相關(guān)的通路富集分析。e配體-受體相互作用網(wǎng)絡(luò)展示了人 HSC/MPP與生態(tài)位細胞之間的潛在通訊網(wǎng)絡(luò)。f熱圖展示主要的人 HSCs/MPPs-生態(tài)位細胞相互作用對。g – h免疫熒光分析展示CD68（代表巨噬細胞）和 CD34（代表 HSCs/MPPs）在人受孕后第 11 周 FL 切片中的表達。i柱狀圖展示有和無細胞相互作用的 HSCs/MPPs 所占的比例。j源自小鼠巨噬細胞和 HSCs/MPPs 共培養(yǎng)系統(tǒng)的人 CD34 + HSCs/MPPs的數(shù)量。

研究結(jié)論

單細胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示了三種具有轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性的亞群，其中CD93+亞群表現(xiàn)出增強的干細胞特性。此外，通過整合單細胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)了新的HSCs/MPPs‘口袋樣’單元(HSC PLUS)，由生態(tài)位細胞 (肝母細胞、間質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞) 組成，并富含生長因子。出乎意料的是,巨噬細胞在HSC PLUS中表現(xiàn)出了11倍的富集結(jié)果。在功能上，巨噬細胞- HSC /MPP共培養(yǎng)檢測和候選分子檢測分別驗證了巨噬細胞和生長因子(MDK、PTN和IGFBP5)在HSCs/MPPs擴增中的支持作用。該研究通過高通量測序技術(shù)解讀了HSCs/MPPs擴增的結(jié)構(gòu)和分子基礎(chǔ)。最后,跨物種分析和功能驗證表明細胞間相互作用和擴增機制具有保守性，但小鼠和人FL的HSCs/MPPs之間的轉(zhuǎn)錄組特征同時存在差異。綜上所述，本文為了解FL中HSCs/MPPs的發(fā)生發(fā)展以及體外功能性HSCs/MPPs擴增提出了的新見解。

參考文章：

Gao, S., Shi, Q., Zhang, Y. et al. Identification of HSC/MPP expansion units in fetal liver by single-cell spatiotemporal transcriptomics. Cell Res (2021). https://doi.org/10.1038/s41422-021-00540-7

原文下載鏈接：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/34341490