【單細(xì)胞+空間轉(zhuǎn)錄組】單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)手共同研究人類肌腱疾病中免疫穩(wěn)態(tài)失調(diào)

英文題目：Single cell and spatial transcriptomics in human tendon disease indicate dysregulated immune homeostasis

發(fā)表雜志：Annals of the Rheumatic Diseases

影響因子：19.104

研究背景

肌腱病，包括以疼痛和功能受限為特征的多因素肌腱疾病仍然是肌肉骨骼醫(yī)學(xué)的重大疑難問(wèn)題。最近的研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了免疫介導(dǎo)機(jī)制在肌腱疾病中的關(guān)鍵作用，印證了通常與炎癥性風(fēng)濕病和肌肉骨骼疾病 (RMD) 相關(guān)的關(guān)鍵的免疫學(xué)和生物力學(xué)因素，在肌腱中也會(huì)表現(xiàn)出來(lái)。單細(xì)胞技術(shù)(scRNAseq) 越來(lái)越多地應(yīng)用于風(fēng)濕病學(xué)，以識(shí)別驅(qū)動(dòng)疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵細(xì)胞表型。盡管在小細(xì)胞數(shù)量和異質(zhì)肌腱活檢方面做出了努力，仍然沒(méi)有詳細(xì)的空間肌腱細(xì)胞圖譜預(yù)知轉(zhuǎn)化目標(biāo)。因此本文利用scRNAseq和空間轉(zhuǎn)錄組（ST）強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合，進(jìn)行細(xì)胞間相互作用分析以構(gòu)建動(dòng)態(tài)細(xì)胞微環(huán)境的圖譜，驅(qū)動(dòng)人類慢性肌腱疾病的發(fā)展。
百邁客提供單細(xì)胞系列產(chǎn)品包括6大核心產(chǎn)品：?jiǎn)渭?xì)胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞免疫組庫(kù)、單細(xì)胞ATAC-seq、單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組。同時(shí)實(shí)現(xiàn)了百邁客單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、空間轉(zhuǎn)錄組APP分析，深入大數(shù)據(jù)挖掘，一鍵快速分析，單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組的聯(lián)合分析近似實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞分辨率的空間異質(zhì)性，助您進(jìn)入時(shí)空組學(xué)研究新時(shí)代。

實(shí)驗(yàn)材料

收集接受肩關(guān)節(jié)手術(shù)的肩袖撕裂患者的岡上肌和肌腱標(biāo)本，只有在術(shù)前MRI掃描中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)肩胛下肌腱病變，或關(guān)節(jié)鏡檢查時(shí)肩胛下肌腱的大面積損傷時(shí)，才納入患者。
患者入組條件：

1) 有肩痛和功能障礙病史

2) 患肩沒(méi)有做過(guò)手術(shù)

3) X線照片無(wú)肩膀骨折

4) 無(wú)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎病史

常規(guī)前交叉韌帶(ACL)重建時(shí)獲得的健康肌腱(腘繩肌腱)作為獨(dú)立對(duì)照組。（在其他體外肌腱研究中，通常也使用腘繩肌腱作為與病變肩腱比較的替代對(duì)照。）

實(shí)驗(yàn)方法

10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、10x Genomics 空間轉(zhuǎn)錄組

岡上肌和肌腱樣本信息

研究結(jié)果

在健康（4例活檢組織，n=3040 細(xì)胞）和患?。?例活檢組織，n=19084 細(xì)胞）肌腱中，發(fā)現(xiàn)同時(shí)存在內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞（圖 1A）。每個(gè)細(xì)胞類型都存在于疾病和健康組織中，但具有不同的定量和定性特征。在基質(zhì)細(xì)胞中鑒定到了一種“壁畫(huà)型”基質(zhì)細(xì)胞（圖 1B）。包含有周皮細(xì)胞的壁細(xì)胞，可能是肌腱中的祖細(xì)胞；有趣的是，這些細(xì)胞在表型上與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 (RA) 滑膜中NOTCH3高壁細(xì)胞相似，后者可以在通過(guò)JAG1與內(nèi)皮細(xì)胞 (EC) 相互作用分化為成纖維細(xì)胞。

圖1 健康和患病人肌腱的細(xì)胞組成和相互作用 A-D

(A) 使用正常（n=4，人腘繩肌腱）和患?。‰觳?，n=5，人岡上肌腱）人肌腱用于單細(xì)胞分析。UMAP展示了具有標(biāo)記基因的內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、基質(zhì)肌腱細(xì)胞和基質(zhì)壁細(xì)胞。(B) 肌腱的基質(zhì)細(xì)胞：壁肌腱細(xì)胞 (mT)、正常肌腱細(xì)胞 1 (nT1)、正常肌腱細(xì)胞 2 (nT2)、患病肌腱細(xì)胞 1 (dT1)、患病肌腱細(xì)胞 2 (dT2)、患病肌腱細(xì)胞 3 (dT3) 和患病循環(huán)肌腱細(xì)胞 (dTc)。(C) 肌腱的免疫細(xì)胞：樹(shù)突狀細(xì)胞 (DC)、巨噬細(xì)胞 1 (Macro1)、巨噬細(xì)胞 2 (Macro2)、循環(huán)巨噬細(xì)胞 (Macro-C)、T-Cells1 (T-Cell1) 和 T-Cells2 (T-Cell2)。(D) 肌腱的內(nèi)皮細(xì)胞 (EC)：CD36 high EC (CD36EC)、E-Selectin EC (CD62eEC)、膠原 4 血管 EC (COL4aEC)、免疫樣 EC (ImmuneEC)、LYVE1 陽(yáng)性 EC (LYVE1EC) 和 SEMA3G 陽(yáng)性 EC (SEMA3GEC)。

細(xì)胞間相互作用和ST分析表明類似的現(xiàn)象可能也會(huì)肌腱病的壁細(xì)胞和SEMA3G ECs之間發(fā)生（圖1F）。在所有患病的基質(zhì)細(xì)胞群中，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白基因（例如COL1A1、COL3A1、FN1、BGN）表達(dá)量更高，這被認(rèn)為是肌腱病的標(biāo)志性特征（圖S2B）。此外，通路分析表明基質(zhì)細(xì)胞簇從對(duì)正常肌腱中免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)（圖S3A），轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)免疫細(xì)胞募集和激活，同時(shí)伴隨有患病肌腱中細(xì)胞因子分泌和反應(yīng)過(guò)程的狀態(tài)（圖S3B，C）。

圖2? 健康和患病人肌腱的細(xì)胞組成和相互作用 E-F

(E) 肌腱中的肌腱細(xì)胞-免疫細(xì)胞相互作用（n = 3 健康，4 患病）。來(lái)自健康（粉紅色）和患?。ňG色）肌腱的肌腱基質(zhì)細(xì)胞中APP和MIF表達(dá)的小提琴圖。正常人肌腱中基質(zhì)APP和巨噬細(xì)胞LYVE1 的空間表達(dá)可視化，和患者肌腱中的基質(zhì)MIF和巨噬細(xì)胞CD74空間表達(dá)可視化，方框突出顯示了共表達(dá)區(qū)域。在來(lái)自健康（粉紅色）和患?。ňG色）肌腱的免疫細(xì)胞中LYVE1和CD74表達(dá) 的小提琴圖。Biorender 信息圖總結(jié)了肌腱疾病中肌腱細(xì)胞-免疫細(xì)胞的相互作用。(F) 肌腱中的EC-肌腱細(xì)胞相互作用。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了7種PECAM1 + ECs亞型（圖 1D），包括一種能產(chǎn)生CCL21的LYVE1 + ECs，并發(fā)現(xiàn)該亞群可以調(diào)節(jié)樹(shù)突細(xì)胞 (DC) 遷移。另外結(jié)果顯示CCL21在肌腱病患者的這些細(xì)胞中上調(diào)（圖 S2C）。DC 包含有正常肌腱中的最大免疫細(xì)胞群（圖 1B）。有趣的是，DC 也存在于患病的肌腱中，但是卻表現(xiàn)出更高水平的 DC 激活和更低水平的C1Q基因（調(diào)節(jié)性 DC 標(biāo)記物）（S2D）。通過(guò)進(jìn)一步分析差異上調(diào)基因的通路富集，證實(shí)肌腱病患者中 DC 的激活以及隨后的T細(xì)胞也被激活（圖 S3D，E）。這種激活部分原因可能是由于基質(zhì)蛋白表達(dá)的增加，例如FN1，它可以激活 DC 并導(dǎo)致組織內(nèi) T 細(xì)胞群的改變，這可能有助于驅(qū)動(dòng)疾病發(fā)展慢性化的機(jī)制。

圖S2

此外，在患者肌腱中發(fā)現(xiàn)了三個(gè)巨噬細(xì)胞群，其中之一就是循環(huán)巨噬細(xì)胞（圖 1C，圖 S2A)，這類細(xì)胞群是患病組織所獨(dú)有的。正常肌腱中巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄圖譜分析最類似于組織修復(fù)和碎片清除（圖 1E，圖 S2D）。在正常肌腱內(nèi)發(fā)現(xiàn)APP在肌腱細(xì)胞中表達(dá)，這可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中促進(jìn)表型的分解。然而，在患者的基質(zhì)中APP 的表達(dá)降低，這與患病組織巨噬細(xì)胞內(nèi)LYVE1 的表達(dá)降低相吻合（圖 1E，圖 S2D）。這些巨噬細(xì)胞亞群與RA緩解有關(guān)。
進(jìn)一步的證據(jù)表明基質(zhì)環(huán)境可能誘發(fā)炎癥變化，包括MIF在患者肌腱細(xì)胞中表達(dá)增加（圖 1E，圖 S2B），然后可以通過(guò)其受體CD74誘導(dǎo)促炎作用，CD74在患者肌腱的巨噬細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)（圖 1E ，圖 S2C )。

圖S3

從細(xì)胞間相互作用分析產(chǎn)生ST指示性數(shù)據(jù)表明基質(zhì)誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)。因此假設(shè)肌腱內(nèi)免疫區(qū)室的主要作用是調(diào)節(jié)和解決損傷；然而隨著微創(chuàng)傷的累積，肌腱細(xì)胞發(fā)起的碎片去除和基質(zhì)修復(fù)的基本過(guò)程可能導(dǎo)致免疫區(qū)室陽(yáng)性擴(kuò)增。進(jìn)一步提出，在患者肌腱內(nèi)，免疫穩(wěn)態(tài)可能變得不平衡，激活的免疫細(xì)胞由內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞引發(fā)，促進(jìn)炎癥循環(huán)和異常組織修復(fù)。炎癥環(huán)境，包括在這個(gè)初步肌腱圖譜中明確證明的細(xì)胞因子通路，在一系列炎癥性RMDs中產(chǎn)生有效的免疫干預(yù)。最值得關(guān)注的是在人類肌腱疾病中定位和研究這些通路的潛力。

參考文章：
Akbar M, MacDonald L, Crowe LAN, et al. Single cell and spatial transcriptomics in human tendon disease indicate dysregulated immune homeostasis [published online ahead of print, 2021 May 17]. Ann Rheum Dis. 2021;annrheumdis-2021-220256.