表觀遺傳之基因組印記

說起基因組印記（Genomic imprinting），小編的記憶還停留在上學(xué)幫師兄查印記基因（imprinted genes）數(shù)據(jù)庫(kù)的時(shí)候。那個(gè)時(shí)候其實(shí)根本不懂印記到底是什么，只記住了師兄在耳邊的碎碎念“父本印記則母本表達(dá)父本甲基化，母本印記則父本表達(dá)母本甲基化”。雖然后來做印記方面的工作少了，但是提起基因組印記還是倍感親切（也可能是對(duì)當(dāng)年徹夜的查數(shù)據(jù)庫(kù)的耿耿于懷）。

今年2月份發(fā)表在核酸研究上的一篇工作就采用了10X左右的Nanopore測(cè)序的數(shù)據(jù)進(jìn)行基因印記的相關(guān)研究。作者采用兩種方法（Basecall method基于Fastq數(shù)據(jù)，Signal method基于原始電信號(hào)）對(duì)Nanopore測(cè)序的read進(jìn)行單倍型分配，并識(shí)別父母本等位差異的甲基化區(qū)域。這些等位差異的甲基化區(qū)域中有部分是已知的印記控制區(qū)，同時(shí)結(jié)果與RNA-seq等位特異表達(dá)和RRBS數(shù)據(jù)結(jié)果吻合。因此作者認(rèn)為那些新的等位差異甲基化區(qū)域可能是新的印記控制區(qū)。

關(guān)鍵結(jié)論

1. Nanopore測(cè)序得到的樣品的甲基化水平與RRBS結(jié)果一致性很高

2. Nanopore read比RRBS數(shù)據(jù)更容易進(jìn)行單倍型分配，且85.7%的read能夠被正確分配

3. 不同單倍型間識(shí)別到的差異甲基化區(qū)域可能是候選的印記控制區(qū)

其實(shí)小編還想碎碎念一句，其實(shí)Nanopore數(shù)據(jù)不是只能做CpG，還能做5mC，6mA啦！分析完甲基化還能再分析分析結(jié)構(gòu)變異呀~ 這么一套牛哄哄的數(shù)據(jù)只用來分析CpG還是太可惜啦！

當(dāng)當(dāng)當(dāng)，詳細(xì)解讀來啦～～

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研究背景

基因印記作為一個(gè)經(jīng)典的表觀遺傳現(xiàn)象，是指基因的表達(dá)具有親本選擇的現(xiàn)象，即只一個(gè)親本的等位基因表達(dá)，另一個(gè)親本的等位基因不表達(dá)或很少表達(dá)。印記基因在生長(zhǎng)發(fā)育中。眾多假設(shè)認(rèn)為DNA甲基化是基因組印記的主要機(jī)制，即許多的基因印記是由不同親本來源的等位基因調(diào)控區(qū)的差異甲基化造成的。

研究方法

• RRBS：?B6 X Cast
• RNA-seq：4個(gè)B6 X Cast正反交子代，4個(gè)Cast X B6正反交子代
• Nanopore：B6 X Cast, Cast X B6

研究結(jié)果

• ?Nanopore甲基化結(jié)果與其他技術(shù)結(jié)果一致

對(duì)B6 X Cast雜交的F1子代的雄性胚胎（E14.5）采用MinION平臺(tái)進(jìn)行8X深度的測(cè)序，采用Nanopolish軟件識(shí)別甲基化。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處甲基化水平降低，且如先前報(bào)道一致，胎盤組織的全基因組甲基化水平在50%左右。采用RRBS對(duì)相同樣品進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)技術(shù)平臺(tái)的甲基化水平相似。

• Nanopore測(cè)序的read單倍型有效率更高

作者定義了兩種分配單倍型的方法(Basecall method基于Fastq數(shù)據(jù)，Signal method基于原始電信號(hào)）。作者將測(cè)序數(shù)據(jù)與SNP標(biāo)記的基因組進(jìn)行比對(duì)，如果read上有至少5個(gè)高置信的SNP則將單倍型分配給Nanopore read，對(duì)于RRBS數(shù)據(jù)，只要有一個(gè)SNP即分配單倍型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有24%的RRBS測(cè)序read被分配了單倍型，而74%的Nanopore測(cè)序的read可以被分配單倍型，且父母本等位各一半。同時(shí)對(duì)于雄性樣品，比對(duì)到X染色體上絕大多數(shù)91%的read都被分配為母本單倍型。

為了進(jìn)一步評(píng)估nanopore測(cè)序read分配單倍型的準(zhǔn)確性，作者又測(cè)了B6自交和Cast自交的組織。用相同的單倍型分配步驟，85.7%的read可以正確分配到相關(guān)的基因型，而只有1.5%是錯(cuò)配的。

• 親本特異和品系特異的基因表達(dá)

對(duì)B6和Cast正反交和自交的F1的胎盤組織分別進(jìn)行RNA-seq測(cè)序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)135個(gè)基因具有親本特異表達(dá)，其中88個(gè)是母本等位高表達(dá)47個(gè)是父本等位高表達(dá)。而這135個(gè)基因中，有53個(gè)是已知的印記基因，這其中又有17個(gè)（包含F(xiàn)kbp6, Smoc1/2, Gzmc/d/e/f/g, Zdhhc14 and Arid1b）在近期的研究中被認(rèn)為是印記的。剩下的65個(gè)基因則組成了小鼠胎盤中候選的親本偏好表達(dá)基因。

• Nanopore測(cè)序觀測(cè)到的已知的印記控制區(qū)

作者結(jié)合nanopore read的單倍型和甲基化數(shù)據(jù)來比較親本等位間的甲基化。發(fā)現(xiàn)Nanopore測(cè)序的數(shù)據(jù)非常容易觀測(cè)出已知的印記控制區(qū)的DMR，且與RNA-seq和RRBS的等位特異情況一致。作者發(fā)現(xiàn)Nanopore的數(shù)據(jù)涵蓋了大多數(shù)已知的印記控制區(qū)的差異甲基化，而這種甲基化差異往往會(huì)延伸到印記控制區(qū)外。

作者接下來嘗試去發(fā)現(xiàn)親本等位間的差異甲基化區(qū)域（DMR）以及品系特異的DMR。作者共得到933個(gè)DMR，其中309個(gè)可以被親本的差異所解釋，其余則是源自品系的差異。結(jié)合RRBS單倍型和RNA-seq的數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明了差異甲基化和差異表達(dá)，進(jìn)而找到印記基因上感興趣的DMRs。排名靠前的前20個(gè)DMRs中有15個(gè)對(duì)應(yīng)于已知的印記控制區(qū)。雖然很多排名靠后的DMR可能是假陽性的，但是這些DMR依然包含了已知區(qū)域的印記表達(dá)。

• 差異甲基化分析上長(zhǎng)read的優(yōu)勢(shì)

最后，作者通過幾個(gè)例子闡述了相比于傳統(tǒng)的重亞硫酸鹽測(cè)序，基于nanopore的方法在識(shí)別親本等位DMR上的諸多優(yōu)勢(shì)。這里，小編就不贅述啦。

 

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