各位有做空間轉(zhuǎn)錄組想法的伙伴們，還在為買不到易燃易爆的異戊烷犯難嗎？還在為異戊烷純度不夠煩惱嗎？還在為解決不了異戊烷的問題實驗停滯不前嗎？今天，百邁客跟大家分享幾種空間轉(zhuǎn)錄組組織包埋的方法，沒有異戊烷也可以冷凍組織喲~
組織不應(yīng)直接置于液氮中，因為溫度差可能會導(dǎo)致組織表面沸騰，從而導(dǎo)致氣穴和不均勻的冷凍這可能會破裂并在形態(tài)上破壞組織。如果您有異戊烷且純度足夠高的話，還是推薦您用異戊烷進行組織冷凍的，具體方法如下：
b.將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表明干燥。
c.標記冷凍模具以標記組織的方向，用預(yù)冷的 OCT 填充模具，避免產(chǎn)生氣泡。
d.用鑷子將組織放入含預(yù)冷OCT的模具中，用OCT 覆蓋任何裸露組織的表面，確認沒有氣泡，尤其是在組織附近。
e.用鑷子將模具放到異戊烷中，但不要使異戊烷浸入模具內(nèi)，直到組織凍結(jié)。冷凍時間可根據(jù)組織類型和大小而變化。
f.冷凍后，將組織轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的冷凍管中，然后放在干冰上。
g.將 OCT 包埋的組織塊保存在–80℃的密封容器中，以便長期保存，或立即進行冷凍切片
如果您的新鮮樣本打算直接進行空間轉(zhuǎn)錄組實驗，且實驗室沒有異戊烷的話百邁客在這里給您推薦直接用干冰粉進行組織冷凍包埋，具體方法如下：
b.將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表明干燥。
c.標記冷凍模具以標記組織的方向，用預(yù)冷的 OCT 填充模具，避免產(chǎn)生氣泡
d.用鑷子將組織放入含預(yù)冷OCT的模具中，用OCT 覆蓋任何裸露組織的表面，確認沒有氣泡，尤其是在組織附近。
e.將組織放入干冰粉中，直到組織凍結(jié)。此方法冷凍包埋組織較慢，且須在干冰粉上靜置一段時間，確保組織冷凍均勻，約需30分鐘。
f.冷凍后，將組織轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的冷凍管中，然后放在干冰上。
g.將 OCT 包埋的組織塊保存在–80℃的密封容器中，以便長期保存，或立即進行冷凍切片。
組織冷凍包埋組織的方法就給大家介紹到這里，下面跟大家分享一篇結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)探討小膠質(zhì)細胞與腦外傷關(guān)系的文章。
空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)輔助揭示再生小膠質(zhì)細胞
依賴白介素-6促進大腦修復(fù)的機制
英文題目：Repopulating Microglia Promote Brain Repair in an?IL-6-Dependent Manner
中文題目：再生小膠質(zhì)細胞依賴白介素-6促進大腦修復(fù)
發(fā)表雜志：cell
影響因子：38.637
研究方法
材料：小鼠大腦
方法：通過藥理學(xué)或遺傳方法誘導(dǎo)小鼠大腦中小膠質(zhì)細胞的更替，結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)闡述小膠質(zhì)細胞具有促進修復(fù)和減輕腦損傷引起的認知缺陷的功能。
研究背景
小膠質(zhì)細胞是大腦中最豐富的免疫細胞，在大腦發(fā)育、維持和疾病中發(fā)揮重要作用。這類細胞雖與外周巨噬細胞親緣性不高，但在發(fā)育早期就存在于大腦中，并通過促進神經(jīng)細胞的形成、突觸連接和凋亡細胞的去除，來促進神經(jīng)回路的塑造。小膠質(zhì)細胞被認為在成年大腦中起著類似的生理作用，它們還能對影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性疾病和急性損傷做出強烈反應(yīng)，由于小膠質(zhì)細胞與單核細胞來源的巨噬細胞有許多共同的表型特征，因此闡明它們對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病的作用具有重要意義。然而，小膠質(zhì)細胞不僅被報道在健康成年大腦中介導(dǎo)學(xué)習(xí)相關(guān)的突觸可塑性，而且還在神經(jīng)炎癥和正常老化過程中的病理和認知功能障礙等方面起著關(guān)鍵作用。
具有廣泛小膠質(zhì)細胞活化的慢性非溶解性炎癥是外傷性腦損傷的一個重要特征，本文利用這一特性直接探索小膠質(zhì)細胞在影響神經(jīng)退行性變和認知功能方面的假定作用。在急性期，已知小膠質(zhì)細胞對腦損傷釋放的損傷相關(guān)分子模式作出快速反應(yīng)，然后以ATP依賴的方式向損傷部位遷移,清除細胞碎片被認為是早期小膠質(zhì)細胞活化的有利方面，這是傷口愈合過程的關(guān)鍵部分。另一方面，在炎癥基因表達和/或吞噬現(xiàn)象出現(xiàn)時，許多腦小膠質(zhì)細胞在創(chuàng)傷性腦損傷的慢性階段仍保留激活狀態(tài)，盡管直接證據(jù)不足，這種持續(xù)的激活狀態(tài)通常被認為是有害的。
總的來說，關(guān)于小膠質(zhì)細胞與腦外傷的關(guān)系，仍有很大的不確定性。作為繼發(fā)性炎癥病理的驅(qū)動因素，它們是否確實惡化了神經(jīng)系統(tǒng)的預(yù)后?它們是否妨礙或支持內(nèi)源性修復(fù)過程，或者可能在損傷過程的不同時間階段都存在所有類型的過程?本文將通過一個外傷性腦損傷小鼠模型給出以上問題的答案。
研究結(jié)果
圖1A.?腦外傷后Iba1pos小膠質(zhì)細胞的定量研究圖
圖1B.plx5622處理小鼠術(shù)后12天海馬內(nèi)Iba1pos和TMEM119pos小膠質(zhì)細胞(綠色)的丟失
圖2A.遺傳模型鼠在停止注射DT和TBI后 小膠質(zhì)細胞（紅色）的再生
圖2B . DT與TBI處理后小膠質(zhì)細胞數(shù)目比較灰色線為對照組
與同齡假手術(shù)對照組相比，TBI本身可使遺傳模型小鼠的同側(cè)海馬內(nèi)DCXpos細胞總數(shù)減少＞60%。然而令人驚訝的是，遭受TBI12天后，在遺傳模型鼠小膠質(zhì)細胞再生過程中未成熟DCXpos神經(jīng)元的總數(shù)增加了~2倍（圖3C），用溴脫氧尿苷（BrdU）進行的脈沖追蹤實驗進一步揭示了損傷后新生神經(jīng)元數(shù)量的大量增加，并在小膠質(zhì)細胞再生的TBI小鼠中存活至第12天（圖3D），同時也觀察到了海馬Tbr2pos神經(jīng)元前體的增加和活性，在TBI急性期采用藥理學(xué)方法誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞更新時，DCXpos細胞數(shù)量也有類似的增加，在這些條件下也觀察到更多的Tbr2pos神經(jīng)元前體細胞的存在（圖3E）和活性（圖3F）。為了完全排除外周效應(yīng)和/或脫靶效應(yīng)，直接向模型小鼠海馬中注射DT，僅在局部誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞的再生，再次觀察到TBI后小膠質(zhì)細胞耗竭和再生刺激神經(jīng)再生。
研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷過小膠質(zhì)細胞耗竭和再生的小鼠的大腦海馬組織體積更大（圖3G-I）。
值得注意是，小膠質(zhì)細胞耗竭和再生對神經(jīng)再生的促進作用被限制在一個狹窄的時間窗內(nèi)，即損傷后3天內(nèi)，小膠質(zhì)細胞在此段時間后的更替并不支持新生神經(jīng)元的產(chǎn)生和生存能力的增強。
圖3C.損傷后12天未成熟 DCXpos神經(jīng)元總數(shù)的定量
圖3D.損傷后12天TBI后新生未成熟 DCXposBrdUpos神經(jīng)元的定量研究
圖3E.損傷后12天中間Tbr2pos神經(jīng)元前體細胞的定量
圖3F.損傷后12天增殖中間神經(jīng)元祖細胞(Tbr2posEdUpos)的定量
?圖3 .對照組（G）和plx5622處理后（H）12天的小鼠海馬背側(cè)體積
在確定了TBI急性期活躍的小膠質(zhì)細胞再生能刺激功能神經(jīng)發(fā)生后，接下來探索了介導(dǎo)這些效應(yīng)的可能的信號通路。進一步探索全海馬組織勻漿中與IL-6信號相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)IL6Ra、IL-6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子(IL6st，也稱為gp130 [IL6st/gp130])、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3 (STAT3)的表達量均隨小膠質(zhì)細胞的再生而增加，本文首先證實再生小膠質(zhì)細胞確實是增加IL-6表達的關(guān)鍵因素，然后，確定了存在再生小膠質(zhì)細胞的條件下，海馬顆粒細胞是腦外傷后的主要白介素-6來源（圖4）。
?圖4 .TBI遺傳模型小鼠中IL-6的細胞來源及正在進行再生的小膠質(zhì)細胞
圖5A.基于差異基因表達的12個經(jīng)典通路的分析圖
?圖5B.星形膠質(zhì)細胞C3染色(A1標記)的平均熒光強度
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