【項目案例】群體研究——BSA、遺傳圖譜應(yīng)用案例

利用基因組重測序技術(shù)進行大規(guī)模高通量SNP標記鑒定是當前國際上動植物基因組學的研究熱點。利用得到的大量SNP標記，可以對群體進行高密度遺傳圖譜、BSA、GWAS、遺傳進化等分析。百邁客在群體研究領(lǐng)域又有哪些應(yīng)用呢？下面和小編一起學習一下遺傳圖譜和BSA的項目案例。

遺傳圖譜

遺傳圖譜（Genetic map），是基于全基因組重測序技術(shù)或簡化基因組測序技術(shù)，對某物種家系樣本進行測序，利用生物信息學方法，開發(fā)SNP分子標記，計算標記間的遺傳連鎖距離，繪制高密度遺傳圖譜。利用遺傳圖譜，主要可以進行QTL定位，比較基因組，輔助基因組組裝等科研工作。本研究報道了利用百邁客SLAF測序技術(shù)，對菊花F1群體測序并構(gòu)建高密度遺傳圖譜，用于菊花花型等性狀的QTL定位及候選基因鑒定的研究。

菊花 (Chrysanthemum×morifolium Ramat.) 作為重要的觀賞性植物，花型對于它至關(guān)重要。舌狀花花冠筒基部合生程度（CTMD）和舌狀花相對數(shù)量（RNRF）是影響花型的兩個關(guān)鍵性狀，但由于這兩個性狀構(gòu)成要素相對復(fù)雜，其遺傳機制還未被揭示，進而限制了菊花花型改良的定向育種。
本研究對CTMD和RNRF差異較大的菊花‘Candy’和菊花‘225’親本以及305個F1代雜交群體進行了SLAF-seq簡化基因組測序，測序深度分別為57.48X，59.69X和23.52X，通過分析鑒定得到了234,648個高質(zhì)量SNPs，利用高質(zhì)量的SNPs構(gòu)建了一套總圖距為4301.5cM、平均圖距為0.76cM的菊花高密度遺傳圖譜，為菊花花型遺傳育種研究提供了豐富的遺傳標記。

圖1 雙親的花型表現(xiàn)

圖2 菊花高密度遺傳圖譜

基于這一圖譜，結(jié)合連續(xù)兩年的表型數(shù)據(jù)，對9個菊花花型性狀進行了QTL分析，定位到123個相關(guān)QTLs位點；控制CTMD的QTLs有16個（圖3），其中有3個為主效QTLs，LOD值分別為3.77，5.09和5.23（圖4）；控制RNRF的QTLs有34個（圖5），其中有4個為主效QTLs。LOD值分別為4.11，4.74，4.96和5.22（圖6）。

圖3 CTMD性狀的QTL定位結(jié)果

圖4 CTMD性狀的主效QTL定位結(jié)果

圖5 RNRF性狀的QTL定位結(jié)果

圖6 RNRF性狀的主效QTL定位結(jié)果

為了進一步發(fā)掘潛在的候選基因，將菊花遺傳圖譜與已發(fā)表的近緣物種向日葵和生菜的基因組進行共線性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菊花遺傳圖譜上有150個SNPs標記可以比對到向日葵基因組，0.12%的SNPs標記可以比對到生菜基因組；依據(jù)基因組注釋信息，檢測得到向日葵基因組中有8個候選基因與CTMD和RNRF相關(guān)，生菜基因組中有20個候選基因與CTMD和RNRF相關(guān)。利用同樣的方法，對甘野菊（C. seticuspe）的參考基因組和兩個野生菊花，毛華菊（C. vestitum）和甘菊（C. lavandulifolium） 的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)做了分析，得到了一些與CTMD和RNRF性狀相關(guān)的候選基因。
本研究通過構(gòu)建菊花高密度遺傳圖譜，為菊花高密度遺傳定位和與花型性狀相關(guān)的QTL鑒定提供了有用的基準信息，為進一步闡明菊花花型遺傳機理提供了新見解，同時也有利于加速菊花花型的定向改良育種。

Bulked Segregant Analysis (BSA)

BSA（Bulk Segregant Analysis）分析是利用極端性狀個體混池快速進行功能基因挖掘的常用方法，廣泛應(yīng)用在植物基因克隆方面。利用該方法，可以快速的對單一性狀進行精細定位，加速目標性狀的功能基因組研究進程。本研究利用百邁客SLAF-BSA-seq技術(shù)，結(jié)合親本重測序，對番茄柱頭外露基因進行基因定位，并對定位基因進行功能驗證。

番茄（Solanum lycopersicum）作為自花授粉作物，有著超然的雜種優(yōu)勢，其雜交品種產(chǎn)量高，抗性好，因此番茄在生產(chǎn)上多采用雜交種。目前，在研究番茄雜交育種過程中，利用雄性不育系協(xié)助雜交種子的生產(chǎn)成為了新趨勢。本研究主要從形態(tài)、生理及基因定位三個方面進行研究。
本研究利用石蠟切片法對其結(jié)構(gòu)變化及不育原因進行觀察，觀察不育材料T431（圖1E）與對照材料（圖1B）成熟花柱的橫切，可以看出不育材料T431花柱中的維管束數(shù)目多于對照材料。同時形態(tài)觀察時發(fā)現(xiàn)不育材料花柱直徑顯著大于對照材料，維管束數(shù)目的增多可能直接導(dǎo)致了不育材料花柱直徑變大（圖1C, D, F, G）。觀察成熟花柱的細胞發(fā)現(xiàn)不育材料與對照材料花柱細胞大小沒有顯著差別。因此說明不育材料花柱伸長是由花柱細胞數(shù)目增多導(dǎo)致而非細胞體積變大導(dǎo)致。

圖1 花柱解剖結(jié)構(gòu)圖

采用高效液相色譜法對花柱中不同時期的五種激素含量的變化進行了分析，從整體含量變化來看，不育材料T431中IAA的增長率達到了176.6%，而對照材料中IAA的增長率僅為25.6%，說明不育品種中花柱維管束數(shù)目增多可能是由于IAA水平的升高導(dǎo)致（圖2 A）；GA3含量整體變化趨勢一致，GA3含量在不育材料T431中均高于對照材料（圖2B）；在花發(fā)育前期可育材料中ZT含量高于不育材料T431，后期出現(xiàn)波動（圖2C）；ABA含量在對照材料中從整體上來看呈穩(wěn)步上升趨勢，而不育材料T431中則較為平穩(wěn)，并沒有明顯的變化（圖2D）；不育材料T431中SA含量在花不同發(fā)育時期的變化趨勢與對照材料呈現(xiàn)相反的趨勢（圖2E）。結(jié)果表明不育材料T431中GA3水平的提升，IAA和ZT含量的積累，ABA與水楊酸的不同變化趨勢以及這5種激素間的相互作用均對花柱的伸長產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致不育的發(fā)生。

圖2 T431（不育材料）和DL5（對照材料）中不同激素在不同時期的變化趨勢
1-4分別表不花蕾長度0.5 cm．0.7 cm，0.9 cm，1.1 cm；5-8分別表示花瓣開張角30°，45°，60°，90°。

作者利用親本重測序技術(shù)與Super-SLAF-BSA-seq的方法相結(jié)合來對番茄部位不育基因進行定位。以番茄位置不育型雄性不育材料T431為父本，可育材料DL5為母本進行雜交，得到F1代，再將F1代自交獲得F2代分離群體，在F2代中選取50株不育株和50株可育株，構(gòu)建可育池和不可育池，提取父本和母本的DNA，構(gòu)建父本池和母本池，最終得到4個混池；分析發(fā)現(xiàn)兩個子代混池樣本間共有154,756個SLAF標簽，使用BWA軟件將SLAF標簽定位到番茄基因組上，對不同染色體上的SLAF標簽和多態(tài)性SLAF標簽的數(shù)目進行匯總（圖3）,通過SNP的檢測和過濾，最終得到9,411個高質(zhì)量的可信SNP位點。

圖3 SLAF標簽分布圖（A）和多態(tài)性SLAF標簽分布圖（B）

接著利用混池間差異SNP的深度差異，使用ED算法來分析計算與目的基因相連鎖的區(qū)域，結(jié)果顯示12號染色體上存在兩個較大且較明顯的區(qū)域，這兩個區(qū)域的大小分別為1.75 Mbp和3.15 Mbp，作者最終確定這兩個區(qū)域與目標基因相連鎖，并將其選為候選區(qū)域（圖4）；利用百邁客云平臺分析，在番茄12號染色體上的兩個候選區(qū)域內(nèi)共找到26個候選基因，通過GO、KEGG數(shù)據(jù)庫比對分析，最終將Solyc12g027610.1確定為本研究的候選基因；對該基因功能進行分析發(fā)現(xiàn)，Solyc12g027610.1參與了細胞分裂素的代謝過程，且與多種激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)。另外，Solyc12g027610.1作為一個乙烯受體蛋白，與番茄乙烯受體基因SlETR以及擬南芥中編碼蛋白AtEIN4的乙烯基因高度同源。

圖4 兩個混池的BSA分析結(jié)果

最后，作者對番茄SILst基因進行基因功能驗證及亞細胞定位；亞細胞定位結(jié)果顯示，基因SlLst于細胞核和細胞膜中均有分布；通過對基因SlLst過表達番茄的表型分析進行基因功能驗證，表明基因SlLst在柱頭外露過程中起重要作用。
本研究分析了番茄外露柱頭的形態(tài)變化和激素作用，結(jié)合親本重測序和SLAF-BSA-seq，快速定位到番茄外露柱頭候選基因SlLst，并對基因SlLst進行了功能分析，為基因克隆及分子標記輔助育種提供一條強有力的途徑。

好消息

目前百邁客云平臺已經(jīng)把全基因組重測序分析、BSA分析、GWAS、遺傳進化分析四種測序分析技術(shù)實現(xiàn)了云交付。百邁客云分析平臺整合了目前最主流的分析流程，結(jié)果準確有保證，分析過程簡單易上手，從數(shù)據(jù)上傳到參數(shù)設(shè)置，再到基因組選擇，只需簡單幾步就可以完成項目數(shù)據(jù)的投遞和分析；結(jié)題報告云交付，分析完成即可拿到項目結(jié)果。詳情咨詢當?shù)劁N售！

參考文獻

[1] Song XB, Xu YH, Gao K, et al. High-density genetic map construction and identification of loci controlling flower-type traits in Chrysanthemum (Chrysanthemum × morifoliumRamat.). Hortic Res, 2020.07

[2] Cheng MZ, Gong C, Zhang B, et al. Morphological and anatomical characteristics of exserted stigma sterility and the location and function of SlLst (Solanum lycopersicum Long styles) gene in tomato. Theor Appl Genet. 2020.11