導(dǎo)讀
研究背景：
宮頸癌是全球女性癌癥相關(guān)死亡的第四大原因。全世界每年報(bào)告的新病例超過(guò)500000例（Torre等人，2015年）。盡管目前可用的治療方法，如化療、根治性子宮切除術(shù)和放療，顯示出有希望的結(jié)果，但由于此類(lèi)治療的強(qiáng)烈副作用，每年還是大約有30萬(wàn)人死亡（Franco等人，2001年）。
因此，迫切需要探索能夠有效治療宮頸癌且副作用最小的新分子（Smith等人，2007）。
莎草L.（莎草科），已被證明具有廣泛的生物和藥理功能，包括抗氧化、抗菌、抗炎、抗雄激素、抗癌、抗驚厥、抗糖尿病和止瀉活性（Kamala et al.，2018；Pirzada et al.，2015）。香附子的主要活性成分是揮發(fā)油，包括多種單萜、倍半萜和氧化物。α-Cyperone是香附子根莖中主要的天然倍半萜之一，約占總揮發(fā)油的20%（Soumaya-Kilani et al.，2008）。體外實(shí)驗(yàn)表明，α-Cyperone具有抗炎作用（Hu等人，2017）。在LPS刺激的RAW 264.7細(xì)胞中，α-Cyperone通過(guò)NF-κB信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控抑制促炎因子COX-2和IL-6的表達(dá)（Jung等人，2013）。巧合的是，α-Cyperone通過(guò)激活A(yù)kt/Nrf2/HO-1和抑制神經(jīng)調(diào)節(jié)的NF-κB信號(hào)通路來(lái)抑制LPS誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞的炎癥（Huang等人，2018）。
考慮到香附子在中藥中常用于治療婦科疾?。≒aula et al.，2011），而α-Cyperone是香附子中最有前景的活性成分（Huang et al.，2018；Jung et al。2013），作者推測(cè)α-Cyperone可能在宮頸癌的防治中發(fā)揮重要作用。本研究旨在檢測(cè)α-Cyperone對(duì)HeLa細(xì)胞是否具有抗腫瘤活性，并探討其作用機(jī)制。
結(jié)論
結(jié)果表明，α-Cyperone能抑制HeLa細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。從機(jī)制上講，α-Cyperone通過(guò)線(xiàn)粒體凋亡途徑促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平升高，細(xì)胞色素c、半胱氨酸蛋白酶-3、PARP和Bax的表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步的RNA測(cè)序顯示α-Cyperone抑制HeLa細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活，PI3K抑制劑和激動(dòng)劑證實(shí)了這一點(diǎn)。PI3K抑制劑（LY294002）與α-Cyperone協(xié)同抑制HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)，而PI3K激動(dòng)劑（IGF-1）則消除了這種作用。有趣的是，α-Cyperone和LY294002均能抑制PD-L1的表達(dá)，而IGF-1的補(bǔ)充則能挽救PD-L1的低表達(dá)。綜上所述，作者的研究結(jié)果揭示了α-Cyperone對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用是通過(guò)ROS介導(dǎo)的PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路觸發(fā)的，并且與PD-L1表達(dá)的下降密切相關(guān)。
英文題目：α-Cyperone inhibits the proliferation of human cervical cancer HeLa cells via ROS-mediated PI3K/Akt/mTOR signaling pathway.
期刊雜志：European Journal of Pharmacology
影響因子：3.623
原文鏈接：https://sci-hub.ren/10.1016/j.ejphar.2020.173355
材料與方法
材料：人宮頸癌細(xì)胞HeLa；
Keywords：RNA-seq；
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
一、α-Cyperone抑制HeLa細(xì)胞增殖和抑制既落形成
用CCK-8法檢測(cè)α-Cyperone對(duì)HeLa細(xì)胞體外活力的影響。在指定的時(shí)間（24、48和72小時(shí)）使用不同濃度的α-Cyperone處理HeLa細(xì)胞。如圖1A所示，α-Cyperone對(duì)HeLa細(xì)胞增殖具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性抑制作用。細(xì)胞毒作用48h的半數(shù)抑制濃度（IC50）值HeLa細(xì)胞為35.57±1.58μM。因此，作者在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中選擇了15、30和60μM的α-Cyperone。
在平板克隆形成試驗(yàn)中，與未經(jīng)處理的對(duì)照組相比，經(jīng)不同濃度（15、30和60μM）的α- Cyperone處理的HeLa細(xì)胞形成的集落更少且更小，這表明α- Cyperone以劑量依賴(lài)性方式降低HeLa細(xì)胞的集落形成能力（圖1B）
圖1
二、α-Cyperone誘導(dǎo)G1細(xì)胞周期阻滯
為了研究α-Cyperone是否抑制HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，作者用不同濃度（0、15、30和60μM）的α-Cyperone處理細(xì)胞24小時(shí)，然后收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析。結(jié)果表明，α-Cyperone處理使G1期細(xì)胞百分率增加，G1期細(xì)胞百分率分別增加6.17%、15.20%和21.30%（圖2A）。采用westernblot檢測(cè)cdc25A、cyclind1、CDK6、PCNA、p21和p27的表達(dá)水平，進(jìn)一步探討α-Cyperone對(duì)G1細(xì)胞周期阻滯的作用機(jī)制。作者發(fā)現(xiàn)α-Cyperone下調(diào)cdc25A、cyclind1、CDK6和PCNA蛋白水平，同時(shí)上調(diào)p21和p27蛋白表達(dá)（圖2B）。
這些結(jié)果表明α-Cyperone誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞G1細(xì)胞周期阻滯。
圖2
三、α-Cyperone通過(guò)線(xiàn)粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
采用hoechst 33342染色法研究α-Cyperone對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響。如圖3A所示，HeLa細(xì)胞呈現(xiàn)明亮的藍(lán)色熒光，表明細(xì)胞核凝聚和DNA斷裂。此外，annexin V/PI染色顯示α-Cyperone以濃度依賴(lài)性方式將凋亡細(xì)胞百分比從5.64%增加到38.28%（圖3B）。
線(xiàn)粒體膜電位的變化是細(xì)胞凋亡的典型事件（Suhaili et al.，2017）。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，線(xiàn)粒體膜被破壞，線(xiàn)粒體膜電位去極化，這可以通過(guò)降低JC-1實(shí)驗(yàn)中紅綠色熒光強(qiáng)度比來(lái)衡量。如圖3C所示，α-Cyperone誘導(dǎo)線(xiàn)粒體膜電位的劑量依賴(lài)性喪失。為了進(jìn)一步證實(shí)凋亡細(xì)胞的死亡，作者檢測(cè)了細(xì)胞色素c、半胱氨酸蛋白酶-3、Bax、Bcl-2和PARP的蛋白表達(dá)。如圖3D所示，α-Cyperone處理顯著增加細(xì)胞色素c、caspase-3、PARP和Bax的表達(dá)。相反，Bcl-2表達(dá)降低。這些結(jié)果表明α-Cyperone通過(guò)線(xiàn)粒體凋亡途徑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。
圖3
四、α-Cyperone誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞氧化應(yīng)激
如圖4A所示，在濃度分別為15、30和60μM的α-Cyperone作用48小時(shí)后，Hela細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞ROS分別增加到30.12%、37.30%和94.67%。然后，作者進(jìn)一步確定ROS抑制劑（N-乙酰半胱氨酸，NAC）預(yù)處理是否能保護(hù)HeLa細(xì)胞免受α-Cyperone的細(xì)胞毒作用。如4B所示，與α-Cyperone單獨(dú)治療組相比，NAC和α-Cyperone聯(lián)合治療可顯著降低細(xì)胞色素c、Bax的表達(dá)，增加PCNA和Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果表明，α-Cyperone誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制是通過(guò)破壞氧代謝平衡實(shí)現(xiàn)的。
圖4
五、α-Cyperone抑制HeLa細(xì)胞PI3K/Akt/mTOR通路的激活
作者對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行RNA測(cè)序分析。根據(jù)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，有656個(gè)顯著上調(diào)基因和997個(gè)下調(diào)基因（圖5A）。接下來(lái)，通過(guò)功能注釋對(duì)這些差異基因進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果表明，α-Cyperone影響了與癌癥相關(guān)的多種生物途徑，包括代謝途徑、MAPK信號(hào)途徑、PI3K/Akt/mTOR信號(hào)途徑、細(xì)胞周期和凋亡（圖5B，C）。
為了揭示α-Cyperone對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用機(jī)制，作者通過(guò)westernblot評(píng)估了參與PI3K/Akt/mTOR通路的關(guān)鍵因子的磷酸化（圖5D）。結(jié)果表明，與正常組相比，α-Cyperone作用48h后，HeLa細(xì)胞p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白水平明顯下調(diào)。此外，還利用PI3K抑制劑（LY294002）和PI3K激動(dòng)劑（IGF-1）進(jìn)一步探討了α-Cyperone（30μM）對(duì)HeLa細(xì)胞的作用。如圖5E所示，LY294002（10μM）通過(guò)下調(diào)Bcl-2、caspase3、PCNA、p-Akt、p-PI3K和p-mTOR的蛋白水平來(lái)增強(qiáng)α-Cyperone誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，與Bax和細(xì)胞色素c蛋白的上調(diào)一致。此外，IGF-1（100 ng/ml）減弱α-Cyperone誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
也就是說(shuō)α-Cyperone通過(guò)PI3K/Akt/mTOR途徑抑制細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。
圖5
許多研究表明，腫瘤細(xì)胞通過(guò)利用免疫檢查點(diǎn)逃避宿主免疫監(jiān)視，從而導(dǎo)致癌癥的擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)（Pardoll，2012）。免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）主要通過(guò)阻斷PD-1和PD-L1的結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用（Brahmer等人，2012年）。作者的結(jié)果發(fā)現(xiàn)α-Cyperone抑制HeLa細(xì)胞中PD-L1的活化（圖5D）。鑒于α-Cyperone抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的激活，作者進(jìn)一步探討了PD-L1與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的關(guān)系。結(jié)果顯示，PI3K抑制劑（LY294002）抑制PD-L1的表達(dá)，而PI3K激動(dòng)劑（IGF-1）增強(qiáng)PD-L1的表達(dá)（圖5E）。因此，α-Cyperone通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路抑制PD-L1的表達(dá)。
總結(jié)
本研究表明α-Cyperone通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)具有強(qiáng)烈的抑制作用。此外，α-Cyperone通過(guò)同樣的途徑抑制PD-L1的表達(dá)水平。這些發(fā)現(xiàn)揭示了α-Cyperone抗宮頸癌的機(jī)制，提示α-Cyperone的抗腫瘤活性可能與調(diào)節(jié)程序性細(xì)胞死亡配體1（PD-L1）有關(guān)?；谶@些結(jié)果，α-Cyperone有望成為治療宮頸癌的候選藥物。
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