2021年7月2日，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院與北京百邁客生物科技有限公司合作的文章發(fā)表在NEURO-ONCOLOGY（IF 12.3）上，研究團(tuán)隊(duì)利用RNA-seq、ATAC-seq和Hi-C檢測(cè)技術(shù)，揭示了骨微環(huán)境在脊索瘤發(fā)生中的作用，并將CA2蛋白確定為脊索瘤的治療新靶點(diǎn)，此外，本研究還發(fā)現(xiàn)鹽酸多佐胺可能為脊索瘤治療提供新的選擇。以下是對(duì)該文章的詳細(xì)解讀。
導(dǎo)讀
脊索瘤是一種罕見(jiàn)的間充質(zhì)惡性腫瘤，復(fù)發(fā)率高，致瘤機(jī)制不明確。遺傳物質(zhì)的改變、表觀遺傳調(diào)節(jié)因子和染色質(zhì)空間構(gòu)象在脊索瘤的發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。本研究利用RNA-seq、ATAC-seq和 Hi-C技術(shù)對(duì)脊索瘤和人髓核（HNP）進(jìn)行多組學(xué)檢測(cè)，并結(jié)合影像學(xué)檢查和臨床信息，揭示了骨微環(huán)境在脊索瘤中的重要作用，并且發(fā)現(xiàn)CA2在脊索瘤中高表達(dá)，但在HNP中幾乎不表達(dá)。本研究還發(fā)現(xiàn)可通過(guò)敲除基因或使用鹽酸多佐胺等藥物抑制CA2的表達(dá)，從而抑制脊索瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和遷移，此外，鹽酸多佐胺還通過(guò)阻斷骨髓單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化來(lái)調(diào)節(jié)骨微環(huán)境。綜上，本研究通過(guò)結(jié)合多組學(xué)檢測(cè)技術(shù)，最終揭示了骨微環(huán)境在脊索瘤發(fā)生中的作用，并將CA2蛋白確定為脊索瘤的治療新靶點(diǎn)， 此外，本研究還發(fā)現(xiàn)鹽酸多佐胺可能為脊索瘤治療提供新的選擇。
研究背景
脊索瘤是一種罕見(jiàn)的間充質(zhì)惡性腫瘤，主要發(fā)生在中軸骨，如顱底蝶枕部和骶尾部。在治療上，常規(guī)劑量的放療和化療對(duì)它沒(méi)有作用，因此手術(shù)是主要治療方法 ，但其復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)和相對(duì)較大的腫瘤體積使得腫瘤組織不能被切除干凈，導(dǎo)致局部復(fù)發(fā)率高。因此，迫切需要探索脊索瘤潛在的致瘤機(jī)制和治療新靶點(diǎn)。
在病理學(xué)上，脊索瘤起源于椎體內(nèi)的脊索殘留物，由胚胎晚期不完全擠壓引起。脊索瘤的發(fā)生涉及到幾個(gè)基因的異常表達(dá)，例如TBXT、CDKN2A和LYST。除了基因表達(dá)改變外，染色質(zhì)可及性的改變，以及染色體構(gòu)象的改變，如通過(guò)染色質(zhì)折疊將線(xiàn)性距離較遠(yuǎn)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他順式調(diào)控區(qū)域聚集在一起等，這些改變對(duì)基因的調(diào)控也至關(guān)重要。
本研究利用RNA-seq、ATAC-seq和 Hi-C技術(shù)在脊索瘤和脊索來(lái)源的髓核中綜合分析了基因表達(dá)情況和染色質(zhì)可及性，結(jié)果表明骨微環(huán)境和骨骼系統(tǒng)發(fā)育在脊索瘤發(fā)生中的潛在作用。此外，通過(guò)比較差異表達(dá)基因（DEG），發(fā)現(xiàn)CA2在脊索瘤中高表達(dá)，其抑制劑鹽酸多佐胺可靶向作用于CA2，從而抑制脊索瘤細(xì)胞增殖、遷移、致瘤性和破骨細(xì)胞分化。
實(shí)驗(yàn)方法
材料：細(xì)胞系（原代HNP細(xì)胞來(lái)自24周胎齡的流產(chǎn)胎兒的原代培養(yǎng)細(xì)胞；脊索瘤細(xì)胞系CH22獲自脊索瘤基金會(huì)；骨髓單核細(xì)胞（BMM）來(lái)自C57/BL6小鼠股骨）
方法：RNA-seq、ATAC-seq和Hi-C
研究結(jié)果
1、HNP和CH22細(xì)胞的差異基因分析（DEG）
對(duì)CH22和HNP細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，每種細(xì)胞類(lèi)型內(nèi)的重復(fù)間具有高度相關(guān)性（r2=0.9937 和 r2=0.9841）。與HNP相比，在CH22中鑒定了3,122個(gè)上調(diào)的基因和1,810個(gè)下調(diào)的基因，熱圖和火山圖顯示了幾個(gè)重要的DEG，例如GDA、TBXT、CDKN2A和CDKN2B（圖1A、B）。GO分析顯示DEG與軸突發(fā)育和骨骼系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)（圖1C）；KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT和MAPK信號(hào)通路在脊索瘤腫瘤發(fā)生中富集。
圖1 RNA-seq和ATAC-seq數(shù)據(jù)分析
2、HNP和CH22細(xì)胞的染色質(zhì)差異可接近性區(qū)域分析（DAR）
與HNP相比，在CH22中確定了313個(gè)增加的DAR 和 1,749 個(gè)減少的DAR。DAR的motif分析顯示CTCF、Nkx2-2、Tcfe2a_2、MED-1 和 E2A motif在CH22中高度富集。還確定了DAR中的DEG，如GDA、TBXT和PAX1（圖 1D）。GO分析顯示DAR中的基因與骨骼系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)（圖 1E）；KEGG富集分析顯示這些基因富集在PI3K-AKT信號(hào)通路上。
3、HNP與CH22細(xì)胞間染色體相互作用差異
對(duì)CH22和HNP進(jìn)行Hi-C染色體構(gòu)象捕獲測(cè)序，共獲得1027和8.64億個(gè)有效相互作用對(duì)。相互作用類(lèi)型分析顯示，HNP和CH22的平均順?lè)幢确謩e為1.815和0.69，表明CH22中的染色體間相互作用更強(qiáng)。
染色體相互作用頻率（IR）能夠反映基因組區(qū)域在細(xì)胞核中的相對(duì)位置，與轉(zhuǎn)錄活性相關(guān)。在HNP的IR熱圖中，觀察到在富含基因的短染色體（chr16、17、19-22）中IR較高，尤其是在chr21和chr22之間。在CH22中，chr3和chr15、chr5和chr20、chr2和chr4、chr9和chr13、chr12和chr16之間的IR更高，短染色體（chr16-22）之間的IR更低。IR強(qiáng)度和DEGs/DARs無(wú)顯著相關(guān)性（p = 1）。
4、HNP和CH22細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)變異
與HNP 相比，在CH22中發(fā)現(xiàn)了一些大的染色體結(jié)構(gòu)變異，表明脊索瘤發(fā)生中會(huì)出現(xiàn)的幾個(gè)染色體易位事件，例如chr2和chr4（圖 2A）。在CH22中鑒定了8個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)變異區(qū)域，如在Hi-C中觀察到兩個(gè)明顯的相互作用區(qū)域R5（在chr2 R1和Chr4 R3之間）和R6（在chr2 R2和chr4 R4之間）。H2信號(hào)表明chr2和chr4之間在P1（chr2：55,540,000）和P3（chr4：156,520,000）位置發(fā)生了相互易位。位置P1和P2 (chr2:160,550,000) 之間的強(qiáng)相互作用信號(hào)（H1）表明Chr2中的倒位區(qū)域與易位區(qū)域相鄰（圖 2B）。此外，還發(fā)現(xiàn)了chr12中更強(qiáng)的染色體內(nèi)相互作用信號(hào)（CNV 區(qū)域）（18,040,000-90,120,000bp，圖 2C）和chr9中的缺失區(qū)域（21,640,000-25,360,000bp）。在 CNV 區(qū)域，有187個(gè)DEG，包括一些普遍報(bào)道的與脊索瘤相關(guān)基因，例如KRT8和KRT18（圖 2D），臨床樣本進(jìn)一步證實(shí)了它們?cè)诩顾髁鲋懈弑磉_(dá)。在缺失區(qū)域，鑒定了9個(gè)DEG，包括腫瘤抑制基因，如CDKN2A和CDKN2B（圖 2E）?；贕O和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)CNV區(qū)域中的基因與骨骼系統(tǒng)發(fā)育和癌癥中的蛋白聚糖通路相關(guān)（圖 2F）。
圖2 HNP和CH22細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變異分析
5、HNP和CH22細(xì)胞之間的compartments分析
常染色質(zhì)和異染色質(zhì)可分為兩個(gè)區(qū)域，定義為compartments“A”和“B”。 脊索瘤A/B compartments的基因組和表觀遺傳特征表明，compartments A與較高的基因密度、轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域相關(guān)，而compartments B具有較差的基因密度、與轉(zhuǎn)錄非活躍區(qū)有關(guān)。
在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，染色質(zhì)compartments會(huì)進(jìn)行轉(zhuǎn)換。與HNP相比，CH22的每條染色體中都發(fā)現(xiàn)了compartments轉(zhuǎn)換，尤其是在chr1、9、13-16和22（圖3A）。HNP中9.99%的compartments A在CH22中為compartments B，6.06%的compartments B在CH22中為compartments A，從A到B的轉(zhuǎn)換中基因的表達(dá)顯著下調(diào)（p=1.08 e-74 ），反之亦然（p=4.11 e- 47 ）。
進(jìn)一步標(biāo)記了441個(gè)基因從compartments B切換到compartments A（376 個(gè)下調(diào)和 65 個(gè)上調(diào)）和341個(gè)基因從compartments A 轉(zhuǎn)換到compartments B（38 個(gè)下調(diào)和 303 個(gè)上調(diào)，圖3B、C)。GO和KEGG分析表明它們與骨骼系統(tǒng)發(fā)育和致癌途徑有關(guān)，如癌癥中的PI3K-AKT信號(hào)和蛋白聚糖通路。
圖3 細(xì)胞特異性compartments、TAD邊界和Loop分析
6、HNP和CH22細(xì)胞之間特異TAD邊界分析
compartments由TAD組成，它們?cè)诩?xì)胞類(lèi)型和物種中是保守的。在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，被破壞或新形成的TAD邊界可能導(dǎo)致增強(qiáng)子和啟動(dòng)子之間的相互作用，并調(diào)節(jié)基因表達(dá)。本研究在HNP中檢測(cè)到6,677個(gè)TAD，在CH22中檢測(cè)到4,856個(gè)TAD。TAD 邊界處基因和染色體開(kāi)放富集區(qū)域的富集程度大于TADs內(nèi)部。
研究確定了1,617個(gè)HNP特異邊界和437個(gè)CH22特異邊界，同時(shí)確定了位于HNP和CH22特異邊界的588和62個(gè)DEG，包括CA3、RAB17和TRIB2（圖3D，E）。GO和KEGG分析表明這些DEG與細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用有關(guān)。
7、HNP和CH22細(xì)胞之間的特異Loop分析
在基因調(diào)控中，增強(qiáng)子通過(guò)染色質(zhì)Loop激活啟動(dòng)子。本研究在HNP和CH22中分別檢測(cè)到10,048和12,170個(gè)Loop，中位數(shù)長(zhǎng)度為100,000 bp。通常認(rèn)為，與增強(qiáng)子相關(guān)的Loop可以增加基因表達(dá)。本研究在HNP和CH22中分別鑒定了3,515和4,187個(gè)啟動(dòng)子-增強(qiáng)子loop（圖3F）。其中，ATAC-seq峰分別支持2,495 和1,732個(gè)。此外，在CH22中發(fā)現(xiàn)了比HNP更多的啟動(dòng)子loop和增強(qiáng)子loop。
兩種細(xì)胞類(lèi)型中的loop是高度保守的，分別鑒定了1,226個(gè)HNP特異性loop和3,348個(gè)CH22特異性loop（圖 3G）。在HNP特異性loop中，發(fā)現(xiàn)了45個(gè)在CH22中上調(diào)表達(dá)的基因和41個(gè)在CH22中下調(diào)的基因，以及CH22特異性loop中的75個(gè)CH22上調(diào)基因和129個(gè)CH22下調(diào)基因，例如 GDA、EEF1A2和ADAM12（圖3H)。GO 和 KEGG 分析表明這些DEGs 與軸突發(fā)育、癌癥中的蛋白聚糖通路和 PI3K-AKT 信號(hào)通路有關(guān)。
8、HNP與CH22細(xì)胞的多組學(xué)聯(lián)合分析
為了探索潛在的治療靶點(diǎn)，本研究結(jié)合了位于CH22和HNP細(xì)胞之間的compartments、細(xì)胞特異性TAD和loop中的重疊的DEG，鑒定到了兩個(gè)重疊的DEG（圖 3I），即CA2和THNSL2?；贕O和KEGG功能注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)骨骼系統(tǒng)發(fā)育在脊索瘤發(fā)生中的重要作用。此外，根據(jù)427名脊索瘤患者的影像學(xué)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)所有脊索瘤均在骨結(jié)構(gòu)中被識(shí)別，但并非源自HNP。在四個(gè)外部數(shù)據(jù)庫(kù)中，骨骼是脊索瘤發(fā)生最常見(jiàn)的位置，比例分別為73.98%、79.18%、86.31% 和 86.06%?？偟膩?lái)說(shuō)，在3169例脊索瘤患者中，2439個(gè)脊索瘤位于骨內(nèi)，410個(gè)位于腦脊髓神經(jīng)系統(tǒng)，159個(gè)位于鼻咽和蝶竇，147個(gè)位于軟組織，6個(gè)位于胸腔，8個(gè)位于不明原發(fā)部位。
研究結(jié)論
本研究采用多組學(xué)技術(shù)，對(duì)脊索瘤和HNP中的基因表達(dá)、染色質(zhì)可及性和染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了綜合比較分析，并進(jìn)行了大樣本量驗(yàn)證。結(jié)果不僅證明了骨微環(huán)境與脊索瘤發(fā)生的相關(guān)性，而且還確定了一個(gè)新的治療靶點(diǎn)（CA2）。此外，研究結(jié)果還表明鹽酸多佐胺有望成為脊索瘤的一種潛在治療選擇。
參考文獻(xiàn)
Meng T, Huang R, Jin J, et al. The comparative integrated multi-omics analysis identifies CA2 as a novel target for chordoma. Neuro Oncol. 2021 Jul 2:noab156. doi: 10.1093/neuonc/noab156
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