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發(fā)布于 2021年11月9日

PCR(Polymerase chain reaction)即聚合酶鏈式反應，是一種體外擴增基因的技術(shù)或獲得目的基因片段的方法。在分子生物學實驗中已占有及其重要的地位。隨著越來越多的基因研究，PCR已走進了實驗人的千家萬戶。請讀者跟著小編的步伐，揭開PCR的神秘面紗！

不少初入基因克隆的新手來說，PCR實驗結(jié)果常常不理想，別急，根據(jù)小編的經(jīng)驗，總結(jié)了大概有以下幾點的原因，或許會幫助屏幕前的你走出誤區(qū)：

PCR擴增無目的條帶

這種結(jié)果的出現(xiàn)是所有失敗里面出現(xiàn)次數(shù)多的情況，比較好的方法就是嘗試更換引物，如果不是以下原因出現(xiàn)的話，引物的好壞決定了PCR實驗的成敗。通常情況下，引物擴增效率高的話，即便溫差在5度，都可以獲得很理想的結(jié)果，且特異擴增。一般選擇引物GC含量在40%-60%，堿基數(shù)在19-23bp即可。GC含量高，可以減少堿基的數(shù)量，含量少，可以增加堿基的數(shù)量。

PCR出現(xiàn)非特異擴增

這種情況的出現(xiàn)一般都是引物的特異性較差，或者也有可能是模板濃度太高，致使模板鏈數(shù)量太多，引物極易錯誤配對，此時可適當稀釋模板，應該會有很好的效果，但還有一種極其特殊的情況，就是出現(xiàn)了污染。
常見污染來源：

1：槍桿的污染，這是實驗室最常見的污染，由于上次吸液動作劇烈，移液時會把上次污染源帶入到實驗中，而PCR最容易受到微量液體的污染，導致實驗失敗。

2：手套等外源核酸酶的污染，以及PCR體系的水一定選擇滅菌水。

PCR條帶弱

有目的條帶，但是濃度低，引物如果沒有問題的話，那就是模板講解的原因。根據(jù)實驗室經(jīng)驗表明，模板最多不凍融超過兩次，四度溶解后保存不能超過一個星期，其實一個星期之內(nèi)，隨著時間的延長，條帶會逐漸減弱，七天之后就沒有了，所以模板的保存很重要。

巢式PCR（nested PCR）

巢式PCR就是利用PCR擴增的產(chǎn)物當模板，在目的基因片段內(nèi)再設計一對嵌套引物，作為巢式PCR引物，此時經(jīng)過幾輪PCR后，目的擴增產(chǎn)物的濃度就會很高，但同時也會引入一些堿基突變。適用于基因表達量低的基因克隆或者提高目的片段的濃度，會有不錯的效果。

半巢式PCR, 利用一個嵌套引物，而不是一對，原理同巢式PCR相似，都會使目的片段增亮幾個級別。

圖1 原始PCR產(chǎn)物

圖2 半巢式PCR產(chǎn)物

小編在做基因克隆時，如果要對圖1PCR產(chǎn)物送去測序，濃度會很低，達不到測序的濃度，當時就利用半巢式PCR, 經(jīng)過切膠，成功獲得了目的片段序列。

產(chǎn)物保存

盡量不要在4度超過一天，DNA很容易降解，保存時間太長的話會對實驗結(jié)果產(chǎn)生一定的影響，超過兩天很有可能就會使條帶消失。建議直接膠回收并進行后續(xù)實驗。

在此，給大家介紹一款百邁客生物公司的 PCR Mix試劑盒–Biomarker HS 2X HF Master Mix，該產(chǎn)品具有以下特點：

高特異性

該試劑盒中的DNA聚合酶添加了能夠抑制酶活性的單克隆抗體，可進行高特異性的熱啟動PCR。

高保真性

該酶是具備高保真度的熱穩(wěn)定DNA聚合酶之一，其保真度比Pyrococcus furiosus DNA聚合酶高6倍。

平末端擴增產(chǎn)物

該酶具和3′-5’和有5′-3’持續(xù)合成活性酸外切酶活性，其擴增產(chǎn)物為平末端。

操作簡單

該預混液中僅需加入DNA 模板、引物和水即可進行擴增。