近年來，空間轉(zhuǎn)錄組在臨床醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)研究中的作用越來越顯著，先后被Nature Methods(2020)、Nature(2022)評(píng)為年度應(yīng)用技術(shù)。為了讓更多想要進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組項(xiàng)目的科研工作者對(duì)其實(shí)驗(yàn)有個(gè)初步的了解。今天小編整理了一些常見的問題，按照樣本準(zhǔn)備、冷凍包埋、切片質(zhì)檢、組織優(yōu)化、基因表達(dá)五個(gè)部分，一一為各位老師解答。
樣本準(zhǔn)備
Q1：哪些動(dòng)植物組織適合做空間轉(zhuǎn)錄組？
A1：動(dòng)物：肝臟、腎臟、腸道、胚胎、大腦、胃、膽管、肺、心臟、血管、肌肉、膀胱、卵巢、脊髓、眼球、幼蟲(昆蟲)等重要組織器官。
植物：草本或木本植物的花苞、幼芽，幼嫩的果實(shí)或種子，愈傷組織等。
Tips：上述僅為部分組織舉例，由于不同物種差異較大，不局限于上述組織。
Q2：做空間轉(zhuǎn)錄組，我該如何準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)樣本？
A2
- 樣本類型
必須是OCT包埋的冷凍塊，動(dòng)物可采用異戊烷或者干冰冷凍，植物依據(jù)組織不同采用合適的包埋方法。
- 具體要求
樣本大?。骸?.5/6.8 mm3?, 厚度滿足1 mm以上，組織截面覆蓋小于25%建議多個(gè)包埋成一個(gè)OCT包埋塊，組織間隔盡量小，但是不要重疊，多個(gè)組織保持在一個(gè)水平面充分利用捕獲區(qū)域。
- 備份
植物需要：3-5個(gè)包埋塊/樣（質(zhì)檢、切片厚度調(diào)整、捕獲區(qū)域確定）
動(dòng)物需要：>3個(gè)包埋塊/樣（質(zhì)檢、組織透化、備份）
不同組織覆蓋區(qū)域的樣品展示
Q3：是否只要包埋盒能容納組織，就不會(huì)超出芯片捕獲區(qū)范圍？
A3：百創(chuàng)S1000平臺(tái)芯片的捕獲區(qū)大小是6.8×6.8mm，10x Visium平臺(tái)芯片的捕獲區(qū)大小是6.5×6.5mm。用于冷凍包埋的包埋盒廠商規(guī)格是7*7*5mm，但其實(shí)際的尺寸為10*10*5mm。如果完全按包埋盒的大小裁剪組織，將包埋盒填滿組織，不留空隙，可能會(huì)導(dǎo)致組織超出芯片的捕獲區(qū)域，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。所以，太大的組織盡量裁剪成6.5×6.5/6.8×6.8mm2大小，并去除組織目標(biāo)區(qū)域之外的其余組織。
百S1000和10x Visium芯片組成創(chuàng)
冷凍包埋
Q4：動(dòng)植物冷凍包埋有哪些方法？
A4
動(dòng)物：
| 推薦的包埋方法 | 方法流程 |
| 方法一 | 異戊烷和液氮浴冷凍包埋 |
| 方法二 | 干冰粉/干冰粒冷凍包埋 |
植物：
| 組織類型 | 推薦的包埋方法 | 方法流程 |
| 幼莖、根 | 方法一 | 固定+抽真空+冷凍包埋 |
| 幼芽、花苞、葉片、籽粒、幼果 | 方法二 | 抽真空+冷凍包埋 |
| 愈傷組織 | 方法三 | 直接冷凍包埋 |
詳細(xì)包埋實(shí)驗(yàn)方法可以掃描文末二維碼聯(lián)系我們領(lǐng)取《百邁客空間轉(zhuǎn)錄組樣本準(zhǔn)備指南》
Q5：為什么花苞、幼芽這類組織需要抽真空處理？
A5:植物花苞、幼芽組織空隙較多，如果不進(jìn)行抽真空處理，在展片的步驟組織有可能會(huì)脫落。切片時(shí)，組織空隙沒有OCT支撐會(huì)導(dǎo)致組織出現(xiàn)破碎。可以將內(nèi)部空隙多的組織部分切開，讓OCT進(jìn)入組織空隙起到支撐的作用，降低后續(xù)實(shí)驗(yàn)失敗的風(fēng)險(xiǎn)。
切片質(zhì)檢
Q6：切片厚度是固定的嗎？
A6:不是，大部分動(dòng)物組織的細(xì)胞大小在10μm左右，我們切片厚度會(huì)選取10μm。植物細(xì)胞往往比動(dòng)物細(xì)胞稍大一些，因此會(huì)根據(jù)組織類型對(duì)切片厚度進(jìn)行測(cè)試和調(diào)整。
不同植物組織切片展示
Q7：你們?nèi)旧玫氖裁丛噭?/strong>
A7：動(dòng)物組織采用HE染色，即蘇木精—伊紅染色。蘇木精染液為堿性，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核酸著紫藍(lán)色；伊紅為酸性染料，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色。植物組織采用甲苯胺藍(lán)染色，甲苯胺藍(lán)是一種多色堿性染料，可使植物組織和細(xì)胞的不同成分染成不同的顏色。木質(zhì)化部分呈藍(lán)綠色，韌皮部呈藍(lán)紫色，其他部分呈淺的藍(lán)綠色。
Q8：我的空間轉(zhuǎn)錄組樣品，要開始實(shí)驗(yàn)了，怎樣知道樣品是否合格？
A8：一般從包埋好的組織塊切10-15片,進(jìn)行RNA質(zhì)檢，要求RIN＞7.0。
Q9：為什么有些植物組織容易脫片呢？
A9：部分植物組織纖維化程度高或淀粉含量高，與玻片的粘附性差，后續(xù)組織優(yōu)化和基因表達(dá)均在液體環(huán)境中進(jìn)行，容易發(fā)生脫片。
Q10：組織切片脫片有什么好的解決方法嗎，如果脫片會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果嗎？
A10：盡量選擇纖維化程度低、淀粉含量低的幼嫩時(shí)期樣本來做空間轉(zhuǎn)錄組。當(dāng)切片質(zhì)檢或組織優(yōu)化時(shí)就出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，后續(xù)正式實(shí)驗(yàn)極大可能再次發(fā)生脫片影響實(shí)驗(yàn)正常進(jìn)行。如果前期實(shí)驗(yàn)均未脫片，基因表達(dá)階段已經(jīng)透化一段時(shí)間后才出現(xiàn)的脫片，此時(shí)絕大部分mRNA已經(jīng)透化下來被對(duì)應(yīng)位置的引物所捕獲，如果聚類結(jié)果與形態(tài)結(jié)構(gòu)吻合是不影響后續(xù)結(jié)果分析的。
組織優(yōu)化
Q11：組織優(yōu)化如何選擇最*時(shí)間點(diǎn)，有哪些注意事項(xiàng)？
A11：對(duì)動(dòng)植物組織進(jìn)行組織優(yōu)化時(shí)，通過酶處理的時(shí)間梯度和熒光標(biāo)記的 cDNA信號(hào)強(qiáng)度，來確定最*的透化時(shí)間。選擇熒光信號(hào)強(qiáng)度最*、彌散最*的透化時(shí)間點(diǎn)作為后續(xù)正式基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)的最*時(shí)間點(diǎn)。
- 一般同一種組織類型，多指生物學(xué)重復(fù)樣本組織透化做一次即可；
- 存在差異樣本均需要組織優(yōu)化：不同物種、組織、時(shí)期、厚度、切片、位置、染色等；
- 百邁客實(shí)驗(yàn)員已經(jīng)積累大量經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)建動(dòng)植物組織優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)體系，保證組織優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確判讀，可供高質(zhì)量的報(bào)告數(shù)據(jù)。
不同透化時(shí)間的動(dòng)植物切片樣本
基因表達(dá)
Q12：做基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)的組織切片和切片預(yù)實(shí)驗(yàn)的是同一張切片嗎？
A12：不是，空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)流程中，每一步都要重新從包埋塊切片，而不是直接從切好的片中找，每次貼到芯片上的都是新的切片。
Q13：已經(jīng)貼到表達(dá)玻片上的樣本不是我想要的，能取下重新貼嗎？
A13：不可以，已經(jīng)貼片的樣本和表達(dá)玻片緊密地粘附在一起，無法完整地取下，強(qiáng)行取下切片后會(huì)使spot點(diǎn)上的引物脫落，影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。
以上，就是本次關(guān)于空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)常見問題解答的全部?jī)?nèi)容了，如果還有其他關(guān)于空間轉(zhuǎn)錄組的疑問，歡迎各位老師留言！
百邁客提供高質(zhì)量空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)
空間轉(zhuǎn)錄組從組織切片、染色到組織透化的實(shí)驗(yàn)過程，也直接關(guān)系到分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量，百邁客實(shí)驗(yàn)人員經(jīng)過大量的項(xiàng)目積累，創(chuàng)建了動(dòng)植物組織優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)體系，保證組織優(yōu)化結(jié)果準(zhǔn)確判讀，可提供高質(zhì)量的報(bào)告數(shù)據(jù)。目前實(shí)測(cè)組織類型100+，包括人、小鼠、大鼠等物種的腫瘤樣本、胚胎樣本、肝臟樣本、肺部樣本、腦部樣本等；蝴蝶蘭、擬南芥、番茄、菊花、白菜等物種的花苞、幼芽、愈傷組織等。此外，更是突破了動(dòng)物血管、軟骨、皮膚類組織的切片、透化難點(diǎn)，為高質(zhì)量數(shù)據(jù)分析提供了保障。
百邁客空間轉(zhuǎn)錄組項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)
百創(chuàng)S1000成功案例展示
某動(dòng)物大腦：
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某動(dòng)物泌尿器官：
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某動(dòng)物腸道：
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免疫器官腫瘤：
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