成功案例詳解！基因組及重測(cè)序助力野生枇杷基因組進(jìn)化和果實(shí)馴化規(guī)律研究！

2022年12月，西南大學(xué)梁國魯教授團(tuán)隊(duì)完成了野生枇杷高質(zhì)量基因組和種質(zhì)資源重測(cè)序研究，相關(guān)研究成果“Genome assembly of wild loquat (Eriobotrya japonica)?and resequencing provide new insights into the genomic?evolution and fruit domestication in loquat”發(fā)表于園藝學(xué)國際頂刊期刊《Horticulture Research》上。百邁客有幸參與了該研究，完成了其中基因組、群體和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析等工作。

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研究背景

枇杷是世界受歡迎的果實(shí)之一，它與蘋果、梨、草莓等經(jīng)濟(jì)物種同屬于薔薇科。枇杷起源于中國，已種植了2000多年，現(xiàn)已廣泛分布在全球30多個(gè)國家，其水果含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括糖類、氨基酸、維生素、有機(jī)酸和礦物質(zhì)等。此外，其果實(shí)在食品工業(yè)中也常用來制作果汁、葡萄酒、糖漿和果醬。枇杷在進(jìn)化和馴化歷史上一直存在爭(zhēng)議。目前，野生枇杷為系統(tǒng)進(jìn)化和育種提供了大量寶貴的遺傳資源，野生和栽培種質(zhì)間的遺傳變異變異研究有助于更好地了解作物物種的馴化過程，同時(shí)也為功能基因鑒定提供有效的途徑，后期可以更好地應(yīng)用于遺傳改良。然而，由于復(fù)雜的遺傳背景和悠久的栽培歷史，野生枇杷和栽培枇杷之間的基因組進(jìn)化規(guī)律仍不清楚。

材料方法

Denovo：~159.8 Nanopore?reads（~198.5×），IIIlumina reads，Hi-C，~8G?RNA-seq?data基因組注釋

重測(cè)序：26份栽培枇杷和11份野生枇杷，Illumina測(cè)序，~22.49×

轉(zhuǎn)錄組：果實(shí)未成熟（GF）、果實(shí)轉(zhuǎn)色（CT）和果實(shí)成熟（FR）3個(gè)時(shí)期轉(zhuǎn)錄組分析

代謝組：Jinhua No. 2 FR與GZ-23 FR，Huabai No. 1 FR與GZ-White FR，?LC-MS/MS廣靶

研究結(jié)果

1、野生枇杷GZ-23基因組的組裝及注釋

作者對(duì)野生枇杷（Eriobotrya japonica?Lindl.）（2n = 34）的基因組進(jìn)行了研究，與流式細(xì)胞儀預(yù)估的結(jié)果（～760Mb）相一致，k-mer分析結(jié)果顯示基因組大小為737.06 Mb。隨后，利用152.6 Gb的ONT數(shù)據(jù)（reads N50 = 31.6kb）進(jìn)行基因組組裝，同時(shí)利用二代數(shù)據(jù)糾錯(cuò)和Hi-C數(shù)據(jù)掛載，成功組裝了分布在17條染色體上的783.7 Mb的野生枇杷基因組序列（圖1）；其中，scaffold N50和contig N50分別為41.8Mb和3.9Mb。二代轉(zhuǎn)錄組的回比率為98.7%，CEGMA和BUSCO評(píng)估分別為98.03%和98.27%，表明GZ-23基因組組裝的完整性較好（表1）。進(jìn)而結(jié)合從頭預(yù)測(cè)、同源比對(duì)預(yù)測(cè)和轉(zhuǎn)錄組輔助預(yù)測(cè)，共預(yù)測(cè)到45,791個(gè)基因，鑒定到59.75%的基因組重復(fù)序列，此外，還鑒定出5381個(gè)rRNAs、765個(gè)tRNAs和129個(gè)miRNAs。

 

2、野生枇杷與12個(gè)物種的比較基因組分析

為研究野生枇杷基因組特征及進(jìn)化，作者將其與藍(lán)星睡蓮、水稻、鐵皮石斛、番茄，茶樹、獼猴桃、蘋果、白梨、野草莓、擬南芥，杧果和葡萄基因組進(jìn)行比較基因組分析，通過基因家族聚類，發(fā)現(xiàn)92%（42,150）的蛋白編碼基因聚為20,668個(gè)基因家族，其中523個(gè)基因家族為枇杷特有的單拷貝（圖2A），主要參生物學(xué)質(zhì)量調(diào)控、激素水平、定位、運(yùn)輸和生長素極性運(yùn)輸?shù)壬镞^程。通過4DTv和Ks對(duì)全基因組復(fù)制事件分析表明，枇杷基因組中發(fā)生了兩次全基因組復(fù)制（WGD）事件，最近的WGD事件發(fā)生在30-45 Mya，而古WGD可能發(fā)生在已知的約120~130 Mya的古六倍化WGT(γ)事件。系統(tǒng)分化表明，枇杷與蘋果和梨擁有共同的祖先，這三個(gè)物種的分化發(fā)生在最近的一次WGD事件之后，通過比較分析，枇杷基因組104個(gè)基因家族發(fā)生擴(kuò)張，僅有一個(gè)基因家族發(fā)生收縮，GO富集分析表明，發(fā)生擴(kuò)張的基因家族主要參與花粉識(shí)別、分生組織發(fā)育與維持、免疫反應(yīng)、和DNA代謝過程的調(diào)節(jié)等生物過程；KEGG分析表明，主要參與半乳糖代謝、氨基酸代謝、氨基糖/核苷酸糖代謝、氮代謝、不飽和脂肪酸生物合成等通路。收縮的基因家族的生物學(xué)過程只參與了蛋白質(zhì)磷酸化。

3、枇杷種質(zhì)多樣性研究

對(duì)26個(gè)典型的枇杷栽培種質(zhì)資源（代表全球不同地區(qū)的栽培種質(zhì)資源）和11個(gè)來自中國西南地區(qū)的野生種質(zhì)資源進(jìn)行了全基因組重測(cè)序，平均深度為22.49×，共鑒定出10,978,138個(gè)高質(zhì)量的SNP。系統(tǒng)發(fā)育和主成分（PCA）分析表明，野生種質(zhì)和栽培種質(zhì)聚為兩個(gè)不同的組（圖3A和B）。野生枇杷的核苷酸多樣性(π)（2.28×10^?3）高于栽培枇杷（1.44×10^?3），LD衰減速度快于栽培枇杷（圖3C），期望雜合度和觀測(cè)雜合度的平均值均顯著高于栽培枇杷。進(jìn)一步利用Structure對(duì)種群結(jié)構(gòu)分析顯示，當(dāng)K=2時(shí)，所有個(gè)體被清楚地細(xì)分為野生和栽培種質(zhì)的兩個(gè)特定分支（圖3D）。

果實(shí)品質(zhì)和色澤是枇杷的重要農(nóng)藝性狀，選擇清除分析結(jié)果鑒定到283個(gè)受選擇區(qū)域，包含2,381個(gè)基因，這些基因功能主要涉及糖、有機(jī)酸、脂肪酸、氨基酸、類黃酮、類胡蘿卜素和植物激素的生物合成和代謝途徑（圖4D），參與果實(shí)品質(zhì)與色澤。同時(shí)，收到選擇的還有果實(shí)大小相關(guān)的基因如BZR1、BZR2、IAA26、NAC、SAUR32和SAUR72等。另外，這些基因在淀粉和蔗糖代謝、碳代謝、果糖和甘露糖代謝、植物-病原體相互作用、脂肪酸代謝、苯丙素生物合成、類黃酮生物合成、類黃酮生物合成、類胡蘿卜素生物合成和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路顯著富集。綜合這些結(jié)果，作者提出了一種獨(dú)特的枇杷果實(shí)品質(zhì)和果肉顏色的馴化模式。

4、枇杷果實(shí)中基因表達(dá)特性研究

栽培枇杷的果實(shí)味道優(yōu)于野生枇杷，為了確定參與果實(shí)品質(zhì)的關(guān)鍵調(diào)控基因，作者對(duì)果實(shí)發(fā)育和成熟的三個(gè)階段（即果實(shí)未成熟（GF）、果實(shí)轉(zhuǎn)色（CT）和果實(shí)成熟（FR））進(jìn)行了比較轉(zhuǎn)錄組分析。在3個(gè)發(fā)育階段共表達(dá)了23,275個(gè)基因，其中5,435個(gè)基因表達(dá)存在顯著差異（圖5A和B），這些差異表達(dá)基因（DEGs）可能有助于果實(shí)的獨(dú)特特征，主要富集在淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號(hào)通路等途徑。與野生枇杷相比，栽培枇杷在果實(shí)發(fā)育過程中主要在糖代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、類黃酮生物合成和類胡蘿卜素生物合成等途徑富集（圖5C和D）。其中，淀粉和蔗糖代謝相關(guān)基因均在栽培枇杷的CT和FR期顯著上調(diào)（圖5E）。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)類胡蘿卜素生物合成相關(guān)基因，在紅色果實(shí)中表達(dá)明顯高于白色果實(shí)，與長期以來認(rèn)知一致，即枇杷的紅色果肉是類胡蘿卜素積累的結(jié)果。

5、枇杷果實(shí)中代謝產(chǎn)物變化研究

為了確定FR階段的代謝變化，作者基于廣靶的LC-MS/MS對(duì)野生枇杷和栽培枇杷進(jìn)行了代謝組研究，共鑒定出1040種代謝物，利用層次聚類分析（HCA）和主成分分析（PCA）對(duì)4種枇杷果實(shí)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分類，發(fā)現(xiàn)野生枇杷和栽培枇杷在果實(shí)發(fā)育過程中代謝產(chǎn)物譜存在顯著差異。Jinhua No. 2 FR與GZ-23 FR的代謝組學(xué)分析顯示，共有371個(gè)差異積累代謝物（DAMs），其中149個(gè)上調(diào)，222個(gè)下調(diào)（圖6D）。但是野生枇杷中一些重要的類黃酮類化合物均顯著上調(diào)。Huabai No. 1 FR與GZ-White FR比較，共有413個(gè)DAMs表現(xiàn)出顯著差異，其中上調(diào)63個(gè)，下調(diào)350個(gè)（圖6C）。其中，鼠李糖、棉子糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-甘露糖和肌醇在白肉枇杷中顯著上調(diào)。有機(jī)酸中，茉莉酸和2-吡啶甲酸在白葉枇杷中顯著上調(diào)（圖6E）。

最后，為了進(jìn)一步準(zhǔn)確了解成熟果實(shí)中轉(zhuǎn)錄水平與代謝物變化之間的關(guān)系，作者進(jìn)行了DEGs與DAMs之間的相關(guān)分析，其中，變化趨勢(shì)相同的DEGs和DAMs主要涉及類黃酮、酚酸類、氨基酸及其衍生物、萜類、有機(jī)酸、脂類等（圖7）。

總結(jié)

野生枇杷為改良品種的馴化和育種研究提供了豐富的遺傳資源。作者組裝出野生枇杷染色體水平的基因組，比較基因組研究表明枇杷與蘋果和梨擁有一個(gè)共同的祖先，且在枇杷分化之前就發(fā)生了一次WGD事件?；蚪M重測(cè)序結(jié)果表明，野生枇杷較栽培枇杷具有較高的遺傳多樣性，果實(shí)質(zhì)量、大小和葉片顏色相關(guān)性狀基因在馴化過程中受到了選擇。進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析鑒定到野生和栽培枇杷在果實(shí)發(fā)育不同階段的DEGs和DAMs，關(guān)鍵差異基因和代謝物主要涉及糖代謝、植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、類黃酮和類胡蘿卜素生物合成。這些高質(zhì)量的參考基因組、重測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析為闡明枇杷的果實(shí)馴化和分子育種研究提供了有利保障。

原文鏈接：https://doi.org/10.1093/hr/uhac265