CDD︱單細胞轉錄組測序技術助力魯明/胡剛團隊發(fā)表新成果

2024年11月，南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學系魯明教授、胡剛教授團隊在Cell Death & Differentiation發(fā)表題為”Dural Tregs Driven by Astrocytic IL-33 Mitigate Depression Through the EGFR Signals in mPFC Neurons”的研究論文，使用單細胞轉錄組測序技術等多種技術，深入闡述小鼠硬腦膜免疫細胞的抗抑郁機制，為抑郁癥治療提供了新的潛在治療靶點。接下來是本文的詳細解讀。

文章標題：Dural Tregs Driven by Astrocytic IL-33 Mitigate Depression Through the EGFR Signals in mPFC Neurons

期刊名稱：?Cell Death & Differentiation

影響因子：13.7

合作單位：南京醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院藥理學系

研究對象：小鼠

百邁客生物為該研究提供了10X單細胞轉錄組測序技術服務。

研究背景

抑郁癥是一種常見的精神障礙，表現(xiàn)為長時間情緒低落、失去快樂或對活動的興趣等，其表現(xiàn)不同于正常的情緒變化和對日常生活的感覺。抑郁癥具有發(fā)病率高、臨床治愈率也高，但治療接受率低、復發(fā)率高的特征，目前治療手段有限，約有30%患者接受一線抗抑郁藥物后癥狀無緩解，癥狀有緩解的部分患者會在首次治療后復發(fā)。因此，有必要深入研究認識抑郁癥的生理病理致病機制，為開發(fā)更有效的治療手段提供見解。

材料及方法

材料：8周大C57BL/6雄性小鼠以及6個月大ICR小鼠，構建慢性社交挫敗應激（CSDS）模型。不同基因型小鼠（Il33-/-，Il1rl1-/-，Rag1-/-，F(xiàn)oxp3DTR）購買后，培養(yǎng)1周后再進行實驗。

方法：單細胞轉錄組測序，免疫熒光，RT-PCR，ELISA，Western blot，流式細胞術，細胞實驗，動物實驗等。

研究結果

• 抑郁應激誘導小鼠出現(xiàn)顯著的硬腦膜Treg擴增

研究者首先構建CSDS小鼠模型并經(jīng)過行為學實驗驗證，采用流式細胞術等研究CSDS小鼠硬腦膜-腦界面免疫細胞，發(fā)現(xiàn)Treg（調節(jié)性T細胞）在硬腦膜而不是腦實質中顯著增殖激活，fluoxetine（抗抑郁藥物）顯著激活硬腦膜Treg擴增，這些結果暗示Treg可能在抑郁樣行為發(fā)展中起到重要作用，fluoxetine可能通過增加硬腦膜中的Treg減輕抑郁表現(xiàn)，調控硬腦膜Treg或許是治療抑郁的潛在靶點。

• 定義硬腦膜Treg免疫表型

CSDS小鼠和對照組小鼠硬腦膜分選得到的免疫細胞進行scRNA-seq，結果顯示CSDS小鼠硬腦膜T細胞占比增加，其中Treg和Th17比例增加，Th2比例降低，初始T細胞沒有發(fā)生變化；Treg中，Gata3+?Treg比例提高，初始Treg和Rorx+?Treg比例降低。對照組小鼠硬腦膜和脾臟分選得到Treg進行SMART-seq，發(fā)現(xiàn)與脾臟相比，硬腦膜Treg的Gata3+亞型和Rora+亞型相關基因表達上調。流式細胞術進一步證實CSDS小鼠硬腦膜中GATA3+?Treg顯著增加，RORγt+?Treg數(shù)量無顯著變化。這些表明GATA3+ Treg可能參與抑郁表現(xiàn)的調控。

• IL33/ST2信號參與CSDS應激后硬腦膜中Treg增加

SMART-seq數(shù)據(jù)顯示CSDS小鼠硬腦膜“IL33結合”以及其他內源性分子結合信號通路表達上調；與脾臟相比，CSDS小鼠硬腦膜中表達ST2的細胞比例顯著高于脾臟；硬腦膜Treg富集趨化性通路。scRNA-seq數(shù)據(jù)也顯示CSDS小鼠模型中T淋巴細胞聚群高表達ST2編碼基因，且表達水平高于對照組小鼠的T淋巴細胞；CSDS小鼠模型硬腦膜Treg高表達ST2編碼基因。隨后，研究者將WT小鼠和Il1rl1-/-小鼠硬腦膜Treg細胞轉移到Rag1-/-小鼠并構建CSDS模型，行為學等實驗結果證實，ST2表達是硬腦膜Treg招募和擴張所必須的。IL33-/-小鼠相關實驗也支持了IL33/ST2信號在抑郁期間促進硬腦膜Treg增殖。

• mPFC星形細胞IL33介導了硬腦膜Treg的浸潤

mPFC、海馬、腦脊液等組織的ELISA、qPCR以及Western blot實驗結果表明，CSDS小鼠硬腦膜ST2+ Treg激活所需的IL33來源于腦實質而不是硬腦膜。多重免疫熒光結果表明mPFC處星形細胞是IL33增加的主要貢獻細胞類型。進一步的特異性細胞類型IL33基因表達KO-恢復實驗及相應的行為學實驗、流式細胞術等結果表明，主要是星形細胞來源的IL33介導了CSDS小鼠中硬腦膜Treg的產(chǎn)生。

• 通過增強AREG分泌，硬腦膜Treg抵消了抑郁應激

進一步分析scRNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)T細胞簇還顯著高表達Areg，流式細胞術、Western blot、免疫熒光等實驗表明CSDS小鼠硬腦膜AREG分泌加強，mPFC區(qū)域AREG表達水平顯著降低。通過向CSDS應激小鼠腦延髓注釋AREG的中和抗體并進行檢測，發(fā)現(xiàn)CSDS小鼠表現(xiàn)出更嚴重的抑郁行為。這些結果暗示來源于硬腦膜Treg的AREG可能是抑郁進展中的主要中間物。

• 硬腦膜Treg來源的AREG可以影響CSDS小鼠mPFC的錐體神經(jīng)元

腦免疫熒光掃描結果表明硬腦膜來源的AREG可能特異性的影響mPFC神經(jīng)元活性，TSA多重染色等實驗結果表明，CSDS應激顯著誘導mPFC神經(jīng)元EGFR（AREG是EGFR配體）的表達，硬腦膜AREG去除可顯著抑制mPFC的EGFR激活，小腦延髓池注射的AREG中和抗體只去除了硬腦膜AREG但對mPFC腦區(qū)AREG無顯著影響。通過這些結果，研究者假設神經(jīng)元表達EGFR可以接收硬腦膜Treg來源的AREG，并激活EGFR信號，直接影響神經(jīng)元活性。

為了驗證這一假設，研究者使用AAV抑制mPFC錐體神經(jīng)元EGFR的表達，免疫熒光、Western blot等實驗結果表明，敲除EGFR部分地加重CSDS小鼠抑郁表現(xiàn)，應激誘導的抑郁中mPFC神經(jīng)元EGFR信號起到重要作用，揭示mPFC錐體神經(jīng)元是硬腦膜Treg來源AREG的靶細胞。

隨后研究者使用全細胞膜片鉗技術記錄CSDS小鼠mPFC錐體神經(jīng)元的微小興奮性突觸后電流（mEPSC），發(fā)現(xiàn)20ng/ml AREG條件下，錐體神經(jīng)元的mEPSC振幅顯著降低但頻率沒有變化，表明AREG可抑制AMPA受體功能，降低突觸后位點數(shù)量，進一步降低EGFR+ 錐體神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞。

綜上，研究者推測硬抑郁小鼠腦膜Treg來源的AREG可以通過抑制mPFC錐體神經(jīng)元的過度興奮，抵抗抑郁表現(xiàn)。

研究總結

本研究發(fā)現(xiàn)硬腦膜Treg在神經(jīng)響應抑郁刺激中起到重要作用，硬腦膜Treg與mPFC神經(jīng)細胞通過AREG-EGFR交流，調控抑郁進展。該發(fā)現(xiàn)表明硬腦膜Treg可作為減輕抑郁表型的靶點，為開發(fā)新型診療手段提供了不同思路。