【項目文章】16s測序聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組研究新思路

在瘤胃中的短鏈脂肪酸（SCFAs）對反芻動物的生長和健康起著關(guān)鍵的作用，微生物G蛋白偶聯(lián)受體（GPR）和微生物脫乙?；福℉DAC）可能是這些影響的主要調(diào)節(jié)通路。該研究主要是選用不同比例非纖維碳水化合物攝入（15-30%）的山羊模型，通過轉(zhuǎn)錄組測序和16srRNA測序聯(lián)合研究瘤胃上皮細(xì)胞和瘤胃微生物協(xié)同的響應(yīng)機(jī)制。通過研究發(fā)現(xiàn)，瘤胃中微生物來源的SCFAs對上皮細(xì)胞的生長和代謝受到GPR和HDAC調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的影響，通過對這些調(diào)控機(jī)制和飲食組成的相互關(guān)系的理解，可更深入的了解瘤胃的新陳代謝機(jī)制，更好的促進(jìn)牧業(yè)的發(fā)展。

樣品取材：共6只雄性山羊，隨機(jī)分為兩組，第一組飼養(yǎng)為65%的干草+35%的飼料（MC組），另一組為90%的干草+10%的飼料（LC組）；喂養(yǎng)28d后進(jìn)行取樣。

微生物多樣性樣品：飼養(yǎng)第28天，在清晨喂養(yǎng)0h、2h、5h以及8h進(jìn)行取樣，瘤胃內(nèi)容物用4層紗布取樣 ，收集瘤胃液15ml，-20℃保存用于提取。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控測序取樣：取10cm2瘤胃組織，用冷卻的PBS進(jìn)行清洗，去除肌肉層，取上皮組織切塊于TRIzol保存液保存。液氮速凍5min后，-80保存用于RNA提取。

短鏈脂肪酸（SCFAs）濃度測定：上述樣品加入5%HgCl2用于濃度測定。

測序分析：

瘤胃內(nèi)容物微生物多樣性測序：細(xì)菌V3+V4區(qū)、Illumina Miseq 平臺測序

瘤胃上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序測序： PE125 測序、Illumina Hiseq2500 平臺測序

飼養(yǎng)不同處理組（MC和LC）、喂養(yǎng)取樣不同時間點(diǎn)間瘤胃內(nèi)總短鏈脂肪酸（SCFA）、PH以及短鏈脂肪酸（SCFA）主要成分的變化情況進(jìn)行分析，如下圖。

?圖1.1?總SCFA變化情況

圖1.2?PH變化情況

圖1.3?SCFA主成分變化情況

2、瘤胃微生物多樣性分析：

2.1細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

在細(xì)菌門水平，一共有14個原核的門被鑒定，主要是厚壁菌門（35.7-30.1%），擬桿菌門（26.6-43.6%）、互養(yǎng)菌門（11-7%），且通過門水平維恩圖分析發(fā)現(xiàn)，在兩組（MC和LC）間門水平組成相同，比較分析兩組間微生物變化情況發(fā)現(xiàn)（如圖：FIG2），MC組相比于LC組，互養(yǎng)菌門增長了57%，無壁菌門增長了330%。而黏膠球形菌門降低了63%，纖維桿菌門降低了65%；

圖2.1?兩組間門水平Venn圖分析

圖2.2 兩組間門水平OTU分析

在細(xì)菌屬水平。共鑒定出75個屬水平細(xì)菌，在兩組間共有70個屬，在MC組有三個特有的屬，在LC水平有2個特有的屬，普氏菌屬（10.4-17.9%）在兩組間都為主要屬水平的菌。

圖3.1 兩組間屬水平Venn圖分析

圖3.2?兩組間屬水平OTU分析

2.2 微生物群落的多樣性和豐富性

在門水平，MC組的擬桿菌門和厚壁菌門顯著性高于Lc組（P＜0.05），互養(yǎng)菌門顯著性低于Lc組（如下圖4），通過最大似然法（ML）計算27個豐度大于1% 的OTU進(jìn)行分析顯示，在MC組顯著增加的OTU屬于子單胞菌科，疣微菌科、韋榮球菌科、疣微菌門，相反的，58%（7/12）顯著降低的OTU屬于普雷沃氏菌科（如下圖5）；

?圖4

圖5

3.瘤胃表達(dá)譜分析：

3.1 瘤胃上皮細(xì)胞GPRs和HDACs的表達(dá)譜分析

RNA-Seq測序方法用于研究山羊瘤胃微生物G蛋白偶聯(lián)受體（GPRs）和微生物脫乙酰化酶（HDACs）表達(dá)情況以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，過濾得到127M clean data，平均有83%數(shù)據(jù)比對到NCBI山羊參考基因組，得到73個GPR家族成員和11個HDAC家族成員比對到山羊基因組，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)有20個GPR家族成員和7個HDAC家族成員在瘤胃上皮細(xì)胞中表達(dá)。通過比較LC組中基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)GPR1，87，89A，155顯著上調(diào)（P＜0.05），在MC組中GPR107，游離脂肪酸受體4（FFAR4, also known as GPR120），羥基烴酸受體2（HCAR2, also known as GPR109A）顯著上調(diào)（P＜0.05），通過組內(nèi)基因表達(dá)分析，在兩組內(nèi)都發(fā)現(xiàn)GPR家族中GPR87表達(dá)*高，HDAC家族中HDCA1的表達(dá)*高

3.2 GPRs和HDACs保守序列分析

為了研究GPR和HDAC在進(jìn)化過程中差異表達(dá)的保守序列，通過用所有基因進(jìn)行ML進(jìn)化樹分析，所有的 GPRS和HDACS在脊椎動物門都是高度保守的。研究GPR家族內(nèi)成員的保守序列發(fā)現(xiàn)，在GPR家族成員沒有超過30%的相似性，在HDAC家族成員之間也發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果。

圖6

3.3 差異表達(dá)的GPRS和HDACs基因相關(guān)KEGG通路分析

為了研究GPR和HDAC共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的生物學(xué)意義，改研究注釋了相關(guān)的信號通路和KEGG功能，發(fā)現(xiàn)顯著差異的鄰近基因被分類到瘤胃上皮細(xì)胞的生理調(diào)節(jié)過程，因此發(fā)現(xiàn)了兩類和上皮細(xì)胞生長調(diào)節(jié)有關(guān)系的功能網(wǎng)絡(luò)，其中一類是上皮細(xì)胞生長網(wǎng)絡(luò)（包括細(xì)胞凋亡，增殖和分化，見下圖7），另外一類是上皮細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)（包括輔酶因子和維生素代謝，能量代謝、氨基酸代謝等，見下圖8）；

圖7：上皮細(xì)胞生長網(wǎng)絡(luò)圖

圖8：上皮細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)圖

在上皮細(xì)胞生長網(wǎng)絡(luò)中，基因GPR1，89和155的表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致LAMTOR3蛋白，蛋白激酶和ELK1表達(dá)上調(diào)，這三種蛋白都存在于MAPK信號通路上，和細(xì)胞的增殖分化有關(guān)。此外，GPR1的 表達(dá)增加和酸性酰胺酶（ASAH1）的下調(diào)相關(guān)，ASAH1存在于調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、生存和增殖的信號通路上。對于HDACs家族基因HDAC4,5,6和10基因的上調(diào)和五個調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，生存和增殖基因的下調(diào)有關(guān)。

在上皮細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)中，GPR1、87和89A基因的上調(diào)表達(dá)與輔酶2、4以及4L（ND2，4，4L），ATP5H，NDUFA4有關(guān)，HDAC1的下調(diào)表達(dá)ND6的上調(diào)表達(dá)有關(guān)。以上所有相關(guān)的酶都和能量代謝的氧化磷酸化有關(guān)。

4.轉(zhuǎn)錄調(diào)控和16s rRNA數(shù)據(jù)聯(lián)合分析?

GPR和HDAC的表達(dá)、SCFAS主成分濃度比例以及屬水平細(xì)菌相對豐度關(guān)系分析

通過CCA相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，顯著上調(diào)的GPRs和HDACs與8個顯著增加的微生物屬（56個 OTUS）是呈正相關(guān)，顯著下調(diào)的GPRs和HDACs和9個顯著減少的細(xì)菌屬呈正相關(guān)（63個OTU），然而HDAC1與丁酸鹽的比例呈負(fù)相關(guān)。

該研究得到的結(jié)果揭示，SCFA調(diào)節(jié)的GPR和HDAC共調(diào)控網(wǎng)絡(luò)存在于瘤胃的上皮細(xì)胞，該共調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)作用可作用于動物敏感√確地接受微生物區(qū)的信號調(diào)節(jié)，這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞各種生理學(xué)過程，尤其是細(xì)胞的生長和新陳代謝，在促進(jìn)動物的生長和維持上皮細(xì)胞的完整性起到關(guān)鍵的作用。此外，這些調(diào)控網(wǎng)絡(luò)重要的調(diào)控機(jī)制對于共生的細(xì)菌來說，主要通過調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞生理過程提高細(xì)菌在宿主中的共生條件。通過了解宿主動物和微生物區(qū)之間互相的調(diào)節(jié)機(jī)制，加上相應(yīng)飲食中的外界干預(yù)調(diào)節(jié)因素，可以可持續(xù)性的更好的提高動物的健康和生長。