基因功能研究思路與技術(shù)—植物篇

高通量測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，使得基因數(shù)據(jù)量直線飆升，隨之而來(lái)的就是對(duì)基因功能研究的新挑戰(zhàn)。做完測(cè)序我們得到感興趣的基因或ncRNA，并對(duì)它們的功能、作用機(jī)制做生信方面的分析后，如果我們要深入研究下去，就需要依靠分子實(shí)驗(yàn)手段做篩選到的感興趣基因或ncRNA的功能及作用機(jī)制方面的研究。
基因或ncRNA研究組成模塊本質(zhì)上是差不多的，都是由生物學(xué)問(wèn)題、分子（基因或ncRNA）、功能和機(jī)制、通路組成，而每個(gè)層面又有針對(duì)于不同情況的具體的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，而文章的千變?nèi)f化就在于這些模塊之間、這些技術(shù)之間的不同組合。

01.表達(dá)量檢測(cè)、定位、全長(zhǎng)鑒定：縮小范圍，找到重點(diǎn)

對(duì)于很多研究，第一步一般都會(huì)去驗(yàn)證從測(cè)序結(jié)果中篩選到的基因或ncRNA，主要驗(yàn)證要研究的基因或ncRNA的表達(dá)量（RT-qPCR、northern、WB）、
表達(dá)在組織或亞細(xì)胞間的特異性（RT-qPCR、northern、FISH、GFP融合蛋白、核質(zhì)分離）、序列的準(zhǔn)確性及是否有新的可變剪切（5’/3’RACE）等。

這一步可以縮小研究的范圍，有時(shí)候也會(huì)發(fā)現(xiàn)新的興趣點(diǎn)，比如這篇Journal of Experimental Botany的文章中，作者發(fā)現(xiàn)了slctr4基因的一個(gè)新的可變剪切命名為slctr4vs3，并且在slctr4的3個(gè)可變剪切中只有slctr4sv3與sly-mir-1917呈負(fù)相關(guān)
（負(fù)相關(guān)是miRNA調(diào)控靶基因最常見(jiàn)的方式，說(shuō)明這個(gè)miRNA很可能調(diào)控這個(gè)基因），在后期的Y2H實(shí)驗(yàn)和BiFC實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)slctr4sv3與SlEIN2互作，這樣就打通了miRNA-1917-slctr4-SlEIN2這樣一條通路。

02.基因功能研究

做完這部分基礎(chǔ)的驗(yàn)證后，就需要驗(yàn)證基因或ncRNA的功能，功能的驗(yàn)證主要分兩類(lèi)：獲得性研究和缺失性研究，獲得性研究即通過(guò)VIGS或遺傳轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)基因讓目的基因過(guò)表達(dá)，缺失性研究即用RNAi、CRISPR/Cas9等技術(shù)讓目的基因沉默或突變?yōu)闊o(wú)功能基因。通過(guò)這部分研究可以驗(yàn)證目的基因的功能。

比如這篇發(fā)表在Developmental Cell的章中對(duì)lncRNA COLDWRAP的RNAi敲除品系表現(xiàn)出減少的春化反應(yīng)，將COLDWRAP轉(zhuǎn)入COLDWRAP突變體后，COLDWRAP表達(dá)恢復(fù)了春化反應(yīng)。

03.作用機(jī)制研究：文章容易出彩的地方

目的基因或ncRNA研究完，進(jìn)一步就需要探討目的基因是如何發(fā)揮作用的，比如上述lncRNA COLDWRAP，是通過(guò)什么方式對(duì)春化作用產(chǎn)生影響的呢？這就需要研究COLDWRAP的作用機(jī)制，很多高分文章都是這部分的研究非常精彩！
比如，下面這篇發(fā)表在Plant Cell上的文章，作用機(jī)制部分研究就比較精彩。
作者先在體外，用酵母雙雜交鑒定FRI蛋白互作的蛋白，發(fā)現(xiàn)FRI的N端區(qū)域與其與LRB1和LRB2的相互作用是重要的，F(xiàn)RI的C端區(qū)域和CUL3A的N端區(qū)域是它們相互作用所必需的。之后用GST pull-down驗(yàn)證酵母雙雜交結(jié)果。

之后在體內(nèi)，用BiFC在體內(nèi)驗(yàn)證定位、酵母雙雜交、GST pull-down結(jié)果，用co-IP分析瞬時(shí)表達(dá)FRI和CUL3A再次驗(yàn)證相互作用。

最后通過(guò)體外降解試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)FRI通過(guò)泛素-26蛋白酶體途徑降解，表明CUL3A和LRB1 / 2是FRI降解所必需的，F(xiàn)RI降解是CUL3A，LRB1 / 2和蛋白酶體依賴(lài)性過(guò)程介導(dǎo)。最終得出蛋白酶體介導(dǎo)的FRI降解調(diào)節(jié)擬南芥春化過(guò)程中開(kāi)花的結(jié)論。

?04.把生物學(xué)故事串起來(lái)

好的研究最終能依靠轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)通路等把研究結(jié)果串起來(lái)，系統(tǒng)地解釋一個(gè)生物學(xué)問(wèn)題。

比如上面談到的Plant Cell的文章，作者發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子WRKY34的轉(zhuǎn)錄迅速被冷應(yīng)激誘導(dǎo)，之后構(gòu)建pCUL3A-LUC載體和W-box區(qū)域突變pCUL3A-LUC載體，與WRKY34共注射入煙草和擬南芥葉原生質(zhì)體，來(lái)驗(yàn)證WRKY34以預(yù)測(cè)的W-box與CUL3A啟動(dòng)子結(jié)合以增加其CUL3A轉(zhuǎn)錄，而CUL3A又介導(dǎo)FRI降解調(diào)節(jié)擬南芥春化過(guò)程中的開(kāi)花，從而把生物學(xué)故事由冷誘導(dǎo)—WRKY34轉(zhuǎn)錄—CUL3A轉(zhuǎn)錄—FRI降解—擬南芥春化過(guò)程中的開(kāi)花這樣一條線串起來(lái)。

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