原來基因定位還可以這么玩

        遺傳圖譜作為經典的研發(fā)方法，在功能基因定位中發(fā)揮著重要的作用，為群體遺傳學的發(fā)展做出了巨大貢獻。但是，遺傳圖譜同樣面臨著一個嚴峻問題，就是難發(fā)高水平文章，即便有全基因組重測序或者簡化基因組等高通量測序buff加持，如果無基因精細定位、克隆、驗證等工作，沖擊5分以上文章略顯內容單調。今天圖譜君給大家介紹一篇特別的文章，即通過RNA-seq的方法構建遺傳圖譜，撇開傳統(tǒng)思路，將轉錄組學和遺傳圖譜結合，共同進行功能基因定位研究，希望各位科研汪能有所收獲！

 

背景

        基于DNA水平的重測序和簡化基因組測序已經在植物QTL定位研究中廣泛應用，但是利用連鎖分析進行基因表達研究較少。在這些研究中，將基因表達量作為一個性狀指標，可以對表達基因進行QTL分析，同時對基因調控網(wǎng)絡進行研究。雖然甜瓜在果實品質性狀上存在著廣泛的遺傳變異，但是對這些性狀的基因定位研究卻不多。在該研究中，作者構建了甜瓜RIL群體的轉錄組圖譜，首先定位到2個果肉顏色、香味基因，然后對差異表達基因的調控順式/反式作用元件進行eQTL定位。

材料方法

親本：414（非甜，淺橙色果肉，難聞氣味），Dul（甜味，深橙色果肉，芳香氣味）
群體：RIL，大小99
自然群體：148個甜瓜品種（具有多種果肉顏色）
性狀考察：129個代謝物含量和揮發(fā)性物質含量（如類胡蘿卜素、生育酚、可溶性糖、乙烯釋放量、果肉顏色、果型等）
圖譜構建：隱爾馬科夫模型估計重組bin
轉錄組測序：授粉10-20天，每個line取5株甜瓜的果肉混樣提取RNA，Illumina GAII和HiSeq 2000測序
互做網(wǎng)絡分析：eQTL互做網(wǎng)絡使用Cytoscape 2.8.2

結果分析

1、轉錄組測序及圖譜構建

        每個樣品產生5-15M的100bp序列，與參考基因組比對獲得82140個SNP，甜瓜基因組預測有27427個基因，本研究共有16000個基因表達。以SNP為基礎劃bin，所有個體共檢測到6636個重組事件，產生3663個bin（圖1A），bin的平均長度為72.6kb。遺傳圖譜構建總圖距為2047cM，利用該圖譜進行對之前未能掛載染色體的scffold進行掛載，并對部分組裝錯誤進行了糾正（圖1B中圓圈）。

圖1? ? ? ?A）重組bin圖? ? ? ?B）標記間關系熱圖

2、果實品質性狀定位

        利用群體bin信息，對129個果實性狀（口味，顏色，香氣揮發(fā)性化合物）進行標記關聯(lián)，共檢測到241個QTL，QTL的平均區(qū)間大小為602kb，70%的QTL包含30個以內基因。同時，通過4個已克隆基因（PH、CmACS7、CmMGL、CmAAT1）的重定位，驗證了QTL定位的準確性。

圖2? ? ? A）果實酸度和? ? ?B）果實長度定位結果展示

3、CmThAT 1和CmPPR 1基因定位與驗證

        S-methyl thioesters（s甲基硫脂）是一種揮發(fā)性脂類，對該性狀進行QTL分析，在chr1定位到CmThAT 1基因，為驗證CmThAT 1功能，將CmThAT 1轉入大腸桿菌進行異源表達，發(fā)現(xiàn)轉入CmThAT 1的大腸桿菌中s甲基硫脂顯著積累。同時發(fā)現(xiàn)在RIL群體中，s甲基硫脂的生成量與CmThAT 1基因的表達量呈正相關（r=0.66）。雙親CmThAT 1基因序列多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，子代同親本Dulce多態(tài)性一致的個體與同親本414多態(tài)性一致的個體相比，CmThAT 1基因的表達量和s甲基硫脂含量均較高。

圖3 A）S-methyl thioesters生物合成過程和B）CmThAT 1定位結果

        類胡蘿卜素含量定位到49個QTL，其中chr 8上存在1個共定位基因CmPPR 1（圖4A），PPR蛋白家族與葉綠體和線粒體內基因轉錄后RNA編輯加工相關。雙親CmPPR 1基因外顯子內存在5個SNP（3個位非同義突變），通過對148個自然群體材料CmPPR 1基因中非同義突變SNP的單體型與果肉顏色表型相關性分析發(fā)現(xiàn)，第1外顯子C/G358與果肉白/綠相關，G/T441與淺橙/深橙色相關（圖4B）。

圖4 A）CmPPR 1基因定位和B）CmPPR 1不同SNP類型的表型

4、CmPPR 1影響葉綠體基因的表達

        在檢測到的16000個基因中，8405個基因在子代群體差異表達，對這些基因進行eQTL分析，定位到12703個eQTL，其中34%為順式eQTL。在反式eQTL的調控網(wǎng)絡，CmPPR 1控制著30個基因的表達，其中27個為葉綠體靶向基因。另外，CmPPR 1受MELO3C002382調控，而MELO3C002382控制著33個葉綠體靶向基因。將CmPPR 1和27個葉綠體靶向基因的表達量與葉綠體基因組編碼基因的表達量進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)兩者中大部分成負相關關系，說明這27個葉綠體靶向基因可能有著共同的功能通路。

圖5 A）CmPPR 1 eQTL調控網(wǎng)絡和B）CmPPR 1調控的30個基因與葉綠體基因表達相關性

總結

        轉錄組遺傳圖譜不僅可以進行傳統(tǒng)的圖譜構建和QTL定位，還能夠進行子代樣品間差異基因的分析，同時，結合遺傳圖譜與基因表達量的表型結果進行更深一步的eQTL定位，揭示基因間的調控關系和調控網(wǎng)絡，更加快速和準確挖掘候選基因。

 

        關于轉錄組測序進行遺傳圖譜的構建已有多篇文章報道，圖譜君整理了一下，希望能給大家?guī)硪恍奈从羞^的思路！（掃描下方二維碼下載文章原文?。?/p>