BMC Biology |百邁客重測序遺傳圖譜助力水稻產(chǎn)量與質(zhì)量相關(guān)遺傳位點(diǎn)研究

2018年9月18日，國際知名期刊BMC Biology在線發(fā)表了沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所徐銓老師關(guān)于水稻產(chǎn)量和質(zhì)量遺傳位點(diǎn)研究的文章，該文章不僅解析超級(jí)稻品種“沈農(nóng)265”的基因組，同時(shí)也分析了在不同生態(tài)環(huán)境和不同遺傳背景下功能基因的功能變化，同時(shí)鑒定了多個(gè)候選基因，并使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)驗(yàn)證了基因的功能，該結(jié)果將會(huì)促進(jìn)不同稻區(qū)秈粳稻雜交聚合亞種的遺傳研究。百邁客有幸參與完成了高密度重測序遺傳圖譜的構(gòu)建和QTL定位等工作，為后續(xù)基因挖掘奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

測序：二代HiSeq2500，三代SMRT

分析：重測序遺傳圖譜，轉(zhuǎn)錄組測序，基因注釋

實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：CRISPR/Cas9

秈稻和粳稻為亞洲栽培水稻的兩個(gè)亞種，它們的地理分布以及形態(tài)學(xué)性狀差異明顯，揭示其農(nóng)藝性狀背后的遺傳基礎(chǔ)對(duì)于水稻生產(chǎn)非常重要，然而，其遺傳背景、生態(tài)條件以及農(nóng)藝性狀之間的關(guān)系尚不清楚。沈農(nóng)265（SN265）是我國第一個(gè)商用的超級(jí)稻，它作為中國北方骨干親本引領(lǐng)著育種方向。本研究利用二代和三代測序?qū)Ρ狈骄统?jí)稻SN265和R99進(jìn)行測序，并獲取SN265高質(zhì)量基因組，又構(gòu)建了RIL群體重測序遺傳連鎖圖譜，并對(duì)多個(gè)重要農(nóng)藝性狀進(jìn)行了QTL分析。此外，還發(fā)現(xiàn)若干基因功能隨生態(tài)環(huán)境的變化而改變，并且許多等位基因?qū)Σ煌倪z傳背景呈現(xiàn)差異性的響應(yīng)。

對(duì)RIL群體及其親本進(jìn)行全基因組重測序，每個(gè)RIL系測序深度為6.25×，親本R99與SN265測序深度分別為30×與32×。通過SOAP進(jìn)行比對(duì)和SNPcalling，共得到1,708,775個(gè)SNP，過濾低質(zhì)量后得到1,456,445個(gè)高質(zhì)量的SNP；利用劃bin策略進(jìn)行圖譜構(gòu)建，得到3569個(gè)bins，平均長度為58.17 kb（圖1）；使用百邁客作圖軟件HighMap進(jìn)行圖譜構(gòu)建，總圖距為1965.33 cM，平均圖距僅為0.55cM，與參考基因組共線性分析分析顯示，最小相關(guān)系數(shù)為0.9725

圖1 利用重測序SNP構(gòu)建的bin圖和遺傳圖譜與參考基因組共線性分析

為了填補(bǔ)北方超級(jí)稻高質(zhì)量基因組序列的gaps，作者對(duì)SN265基因組進(jìn)行了de novo測序和組裝。利用P5-C3 SMRT測序，獲得24.94 Gb的原始數(shù)據(jù)，平均讀長為9.6 kb，二代測序共獲得22.05 Gb的原始數(shù)據(jù)，組裝得到SN265的基因組，大小為364.45 Mb，contig N50 達(dá)到6.96 Mb，通過從頭預(yù)測、同源預(yù)測以及RNA-seq分析后共獲得37,609個(gè)基因（圖2）。對(duì)R99進(jìn)行低深度（30×）三代重測序和基因組組裝，獲得了R99389.6 Mb的基因組，contig N50也達(dá)到3.05 Mb（圖2）。

圖2 親本基因組組裝結(jié)果展示

為了闡釋遺傳背景與農(nóng)藝性狀的關(guān)系，作者以粳稻和秈稻亞種間特異SNP計(jì)算得到每個(gè)RIL系的秈型血緣百分比。結(jié)果顯示，秈型血緣百分比主要影響穗長與粒形（圖3）。

圖3 不同秈稻型血緣比例的RIL子代在不同環(huán)境下農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

通過收集三個(gè)地點(diǎn)15個(gè)產(chǎn)量與質(zhì)量相關(guān)的表型數(shù)據(jù)，進(jìn)行QTL的挖掘，結(jié)果共檢測到79個(gè)QTL，許多QTL呈現(xiàn)成簇分布的特點(diǎn)，暗示多種性狀可能由一個(gè)基因或多個(gè)緊密連鎖的基因控制。有些QTL在3個(gè)環(huán)境下均被檢測到，另有一些位點(diǎn)僅在1個(gè)環(huán)境下被檢測到。

為了確定QTL簇的候選基因，進(jìn)一步做了基因的精細(xì)定位。首先，關(guān)注的是chr9上的 qPL9簇，候選基因被定位在43kb的區(qū)間內(nèi)，其中包含7個(gè)注釋基因，通過序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)候選基因DEP1上的exon5中存在堿基序列的替換，即R99中637bp的片斷在SN265中被替換成12bp的序列；接著共分離分析發(fā)現(xiàn)SN265型的dep1具有明顯短于R99的穗長（圖5）。為了證明DEP1是qPL9的候選基因，利用 CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)Sasanishiki品種中的DEP1基因誘變，獲得五個(gè)突變體株系，其中四個(gè)突變體發(fā)生移碼突變，呈現(xiàn)短穗長，另外一個(gè)突變體產(chǎn)生兩個(gè)氨基酸的替換，其穗長與Sasanishiki無顯著性差異（圖5），暗示DEP1是qPL9簇中控制穗長的基因。

圖5? DEP1精細(xì)定位及CRISPR/Cas9突變結(jié)果

接著在Chr1短臂上的qGP1簇上定位到候選基因Gn1a，在長臂定位到SD1為控制株高的候選基因；在Chr5上鑒定到的GW5上游存在1212bp序列的缺失；在qGS12簇中的Os12g0610600存在一個(gè)SNP，負(fù)調(diào)控水稻耐旱反應(yīng)。而且，基因GW5與qGS12的不同組合形式會(huì)顯著影響水稻種子的粒型。此外， DTH8、SDG708與phytochrome B (PHYB)分別位于Chr8、4、3上，是控制抽穗期的候選基因。

為了揭示生態(tài)環(huán)境與遺傳背景對(duì)基因功能的影響，首先，作者發(fā)現(xiàn)Gn1a對(duì)水稻單穗籽粒數(shù)目的貢獻(xiàn)主要集中在江蘇與沈陽兩個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，而DEP1僅僅在深圳被檢測到是控制單穗籽粒數(shù)目的QTL（圖6）。對(duì)以上三個(gè)種植區(qū)，又進(jìn)一步比較攜帶有 DEP1/dep1與Gn1a/gn1a的不同水稻材料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在高緯度生態(tài)區(qū)dep1對(duì)單穗籽粒數(shù)目的貢獻(xiàn)減少，而gn1a對(duì)其貢獻(xiàn)明顯增強(qiáng)（圖6）。類似地，DTH8、 SDG708與PHYB在江蘇均被檢測到，而PHYB在深圳也被檢測到，同樣, DTH8、 SDG708在沈陽也被檢測到；結(jié)果顯示DTH8、SDG708幾乎不會(huì)影響在深圳的抽穗期，PHYB在沈陽有較弱的作用（圖6）。概括起來，Gn1a、 SDG708、SD1與GW5的功能在高緯度地區(qū)被增強(qiáng)，另一方面，PHYB與DEP1的功能隨著緯度的北移被破壞，有趣的是，DTH8在中緯度地區(qū)具有較強(qiáng)的功能，緯度的南移或北移都會(huì)削弱其功能。

圖6 不同生態(tài)環(huán)境與不同遺傳背景下基因表現(xiàn)的差異

為了揭示遺傳背景對(duì)基因功能的影響，根據(jù)秈型血緣百分比將RIL群體分為三組：粳型、中間型與秈型。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，不同遺傳背景的基因功能也不同，例如，粳型SD1隨著秈型血緣百分比的增加，株高降低，而秈型sd1隨著百分比的增加，株高增加。又比如，在深圳，粳型PHYB隨著秈型血緣百分比增加延遲抽穗期，而在江蘇與沈陽加快抽穗期。此外，在三組群體中，中間型的農(nóng)藝性狀表現(xiàn)最差，例如，在DEP1與Gn1a遺傳背景下，中間型擁有最低的單穗籽粒數(shù)目。

本研究為水稻育種功能基因的利用提供信息,即合適的生長環(huán)境與遺傳背景對(duì)基因功能的影響；北方粳稻品種沈農(nóng)265基因組參考序列的發(fā)布為植物科學(xué)家與作物遺傳改良提供寶貴資源。

1、重測序遺傳圖譜為研究打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

2、不同稻區(qū)多年的表型數(shù)據(jù)，定位到了多個(gè)QTL簇，從而將研究重點(diǎn)放在這些QTL簇上。

3、結(jié)合3代和2測序獲得了沈農(nóng)265高質(zhì)量的基因組序列。

4、獨(dú)辟蹊徑地闡述了基因在不同環(huán)境和不同遺傳背景下功能的轉(zhuǎn)變，這也是本文最大的亮點(diǎn)。

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