Nanopore | 玩轉(zhuǎn)酵母全長轉(zhuǎn)錄組

酵母以其易于基因改良且生長迅速的特點，成為學(xué)術(shù)研究和工業(yè)生產(chǎn)的利器。近些年，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，更是晉升為三代測序技術(shù)的團(tuán)寵。2017年發(fā)表在Genome Research(IF=10.101)上的“The dynamic landscape of fission yeast meiosis alternative-splice isoforms”（請點擊閱讀原文下載）在學(xué)術(shù)圈廣為流傳，是利用 PacBio 研究可變剪接的經(jīng)典案例。

今年酵母搭乘 Nanopore 再發(fā)2篇高分文章（請點擊下載原文），從基因組、轉(zhuǎn)錄組體驗長片段測序的利好。

Nanopore 測序到底怎么樣？可以做定量嗎？和 PacBio 相比如何？

這篇“Complete genomic and transcriptional landscape analysis using third-generation sequencing: a case study of Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D”告訴您?。?a >請點擊下載原文）

 

 

材料和方法

樣品：酵母菌種 CEN.PK113-7D

測序方案：

? 全基因組測序：

? PacBio，Sequel，~4900Mb，N50為8700bp，約408X(PRJNA398797,SRP116559)

? Nanopore，MinIon，~830Mb，N50 為 12500bp，約 69X(PRJNA398797, SRP116559)

? Illumina，HiSeq 2000，先前研究序列(SRS307298)

? 全長轉(zhuǎn)錄組測序：

? Nanopore，MinIon，direct RNA，葡萄糖生長條件和乙醇生長條件，各 4 個 生物 學(xué)重復(fù)(PRJNA398797, SRP116559 )

? Illumina，HiSeq 2000，先前研究序列(SRS307298)

主要結(jié)果

1、基因組數(shù)據(jù)特征分析

相比于 PacBio，MinIon 能產(chǎn)出更長的序列，但是 PacBio 測到的序列數(shù)量是 MinIon 的 5.6 倍左右。大部分的序列在兩個平臺都能檢測到，個別特有的序列可能和實驗階段的片段篩選有關(guān)。

圖 1 MinIon and PacBio 數(shù)據(jù)特征統(tǒng)計

對于不同測序平臺得到的基因組數(shù)據(jù)，采用 3 種組裝方式:只用 MinIon 得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行 de nove組裝得到 ONT_assembly;只用 PacBio 得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行 組裝得到 PacBio_assembly;用 MinIon和 PacBio 得到的數(shù)據(jù)共同進(jìn)行 de nove 組裝得到 OP_assembly。然后使用 Illumina 的數(shù)據(jù)對組裝結(jié) 果進(jìn)行校正。三種組裝方式得到的 2μm 質(zhì)粒都比已知的 S288C 酵母的 2μm 質(zhì)粒更長，而ONT_assembly 的組裝結(jié)果很好，剛好組裝出 16 條染色體，1個線粒體序列，1個質(zhì)粒序列;PacBio_assembly 組裝的線粒體序列是斷裂開的兩段;OP_assembly 組裝出的 contigs 最多，多出 3個端粒 DNA 片段，2 個質(zhì)粒片段，而且組裝時把 VII 染色體和 XIII 染色體的端粒區(qū)域連接在了一 起。 總體來看，三種組裝方式得到的基因組很相近，由于 OP_assembly 的測序深度最高，與 S288C酵母的平均比對率達(dá)到了 99.6%。

表 1 三種組裝方式的數(shù)據(jù)比較

2、全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)特征分析

二次生長(diauxic growth)是指微生物可以利用一種營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，當(dāng)原始營養(yǎng) 物質(zhì)被利用完后，可以進(jìn)一步利用其代謝產(chǎn)物生長繁殖，產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物。最典型的二次生長 現(xiàn)象就是酵母菌的二次生長，即在糖源豐富時，酵母將葡萄糖糖轉(zhuǎn)化為乙醇，當(dāng)葡萄糖耗盡后， 酵母可以進(jìn)一步將乙醇氧化為乙酸，維持生長。

分別對葡萄糖條件和乙醇條件下生長的酵母進(jìn)行全長轉(zhuǎn)錄組測序，葡萄糖生長條件下的酵母 共計獲得~509 MB(59X)數(shù)據(jù)量，包含約 530,000 高質(zhì)量 reads，其中 N50 為 1150bp;乙醇條 件下的酵母共計獲得~623 MB(72X)數(shù)據(jù)，約 623000 高質(zhì)量 reads，其中 N50 為 1263 bp。該 技術(shù)的比對率為 88%，錯誤率為 12%，其中超過 70%的轉(zhuǎn)錄本為全長轉(zhuǎn)錄本，鑒定長度最長轉(zhuǎn)錄 本超過 5kb。全長轉(zhuǎn)錄本的比例隨著轉(zhuǎn)錄本長度增加而減小，與轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量沒有明顯關(guān)系。有22 個轉(zhuǎn)錄本是明顯高表達(dá)的，比如 豐度最高的轉(zhuǎn)錄本之一， 的同源 基因，在兩個培養(yǎng)條件下表達(dá)量都很高;在乙醇條件下特異高表達(dá)一些與熱休克蛋白、氧化脅迫 相關(guān)的基因，其中 編碼檸檬酸合酶，說明此時激活了乙醛酸途徑;在葡萄糖培養(yǎng)條件下，與 有氧呼吸、核糖體相關(guān)的基因表達(dá)量較高，符合此條件下酵母生長更快的特征。

圖 2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)特征統(tǒng)計

3、全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)差異篩選

通過主成份分析(PCA)發(fā)現(xiàn)兩組數(shù)據(jù)有明顯的差異，PC1 的貢獻(xiàn)率達(dá)到 90%。使用 DESeq2做差異分析并對差異基因做 GO 富集分析，結(jié)果顯示葡萄糖培養(yǎng)條件下的上調(diào)基因富集到了與轉(zhuǎn) 錄、翻譯過程相關(guān)的 GO term，與葡萄糖培養(yǎng)條件下生長更快的表型吻合。在乙醇培養(yǎng)條件下， 上調(diào)基因主要富集到了 TCA 循環(huán)，乙醛酸通路，線粒體電子傳遞方面。同時，由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗、 毒性代謝物積累，在乙醇條件下很多與脅迫響應(yīng)，分解代謝，β氧化相關(guān)的基因表達(dá)量上調(diào)。

4、轉(zhuǎn)錄組:MinION VS Illumina

由于 Illumina 產(chǎn)出的是短片段，比對上基因組的 reads 數(shù)比 MinION 要多 10 倍左右。比對上的堿基總數(shù)可以反映測序深度，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn) MinION 約有 0.5G 數(shù)據(jù)，測序深度 64X，Illumina 約有1G 數(shù)據(jù)，測序深度 118X。(圖 3E)而在平均覆蓋率的統(tǒng)計中發(fā)現(xiàn)，兩種平臺非常相似。(圖 3F) 可見，在相似的覆蓋率需求下，MinION 需要的數(shù)據(jù)量更少。

圖 3 轉(zhuǎn)錄組差異分析

5、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)分析

MinION 的數(shù)據(jù)中，我們發(fā)現(xiàn)相鄰的 2 個基因 PTH1 (CENPK0H0281W) 和 ERG9 (CENPK0H0282W) 轉(zhuǎn)錄在一個轉(zhuǎn)錄本中，有大量的 reads 跨越了基因間區(qū)。而 Illumina 的比對結(jié)果中， 在兩個 ORFs 之間的區(qū)域，比對到的 reads 不是完全覆蓋的，這種低置信度的信息很可能被忽略。

圖 4 THI1 和 ERG9 比對結(jié)果可視化

總結(jié)

本文將第三代測序技術(shù)與成熟的生物信息學(xué)分析流程結(jié)合起來，成功組裝出真核生物的基因組。長片段測序使高質(zhì)量、完整的真核基因組序列的重新組裝成為可能，這為比較基因組學(xué)奠定了堅實的基礎(chǔ)。Nanopore 測序能夠準(zhǔn)確測定編碼的 mRNA 位置，基因表達(dá)量，以及轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)。我們相信，Nanopore 測序?qū)⒊蔀槲磥砘蚪M和轉(zhuǎn)錄組重要方式。應(yīng)該注意的是，本文研究的是基因組簡單的酵母，在處理高等生物(動物和植物)的基因組和轉(zhuǎn)錄組時，需要更高的測序深度和更長的讀取。

今年8月份牛津納米孔公司與百邁客公司達(dá)成長期合作，已引入Oxford Nanopore平臺，擁 有 MinION、GridION X5 和 PromethION 三種型號全套納米孔測序儀。

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