全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組解析淡水花羔紅點(diǎn)鮭Toll-like受體和補(bǔ)體系統(tǒng)的免疫作用機(jī)制

研究背景

花羔紅點(diǎn)鮭是溯河產(chǎn)卵魚類，在泛太平洋分布。中國(guó)東北部山區(qū)河流中的花羔紅點(diǎn)鮭終身生活在淡水中。早期研究主要集中于花羔紅點(diǎn)鮭的生長(zhǎng)和地理分布，而對(duì)于淡水花羔紅點(diǎn)鮭抗細(xì)菌感染的免疫系統(tǒng)的影響知之甚少。為了探討花羔紅點(diǎn)鮭適應(yīng)淡水對(duì)其免疫系統(tǒng)的影響，特別是補(bǔ)體系統(tǒng)（complement system）和Toll-like受體（toll-like receptors，TLR）途徑的影響，本文對(duì)細(xì)菌侵染的中國(guó)淡水花羔紅點(diǎn)鮭進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組研究。

材料和方法

• 材料
  中國(guó)通化市鴨綠江上游支流取魚（184.6±23.4g），將魚隨機(jī)分為兩組，腹腔注射嗜水氣單胞菌或相應(yīng)體積的0.9%鹽水。
• 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
  腹腔注射后24小時(shí)，從細(xì)菌注射組中處死3條魚，收集肝臟和脾臟組織等量混合構(gòu)建全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)。
• 測(cè)序平臺(tái)
  北京百邁客生物科技有限公司PacBio RS II 測(cè)序平臺(tái)，構(gòu)建3個(gè)文庫(kù)，0-2kb，2-3 kb和3-6 kb。
• qPCR驗(yàn)證
  分別于注射后0h、6h、12h、24h、36h、48h、72h、96h各處死3條魚，將肝臟和脾臟組織立即液氮速凍，保存-80℃。

 

研究結(jié)果

 

1、cDNA文庫(kù)特征
以中國(guó)淡水花羔紅點(diǎn)鮭為材料，將細(xì)菌注射魚腹腔法，取肝臟和脾臟等量混樣構(gòu)建cDNA文庫(kù)測(cè)序。去除接頭序列和低質(zhì)量序列（＜50 bp）之后，產(chǎn)生了超過14.88 GB clean data，總數(shù)為7,728,364。0-2kb，2-3 kb和3-6 kb分別產(chǎn)生4,565,697、2,087,033和1,075,634 clean data。經(jīng)過質(zhì)量控制、數(shù)據(jù)過濾和去除冗余后，采用31233個(gè)高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本獲得27,829個(gè)轉(zhuǎn)錄本。共鑒定出24,541個(gè)開放閱讀框（ORF），其中17,670個(gè)是完整的。

2、轉(zhuǎn)錄本的功能注釋和分類
對(duì)27,829個(gè)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)功能富集和分類注釋分析，25,809個(gè)轉(zhuǎn)錄本被注釋。NCBI-Nr數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)顯示，轉(zhuǎn)錄本匹配到一系列物種（圖1）。Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)上轉(zhuǎn)錄本共有25,653個(gè)(92.18%)，52.04% 轉(zhuǎn)錄本與虹鱒（Oncorhynchus mykiss）相似，其次是大西洋鮭（Salmo salar）(23.53%)和梭子魚（Esox lucius）(14.01%)，其余匹配的物種不到10%。GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋16,612個(gè)（59.69%）轉(zhuǎn)錄本，富集到兩個(gè)與免疫相關(guān)的亞類，分別是“響應(yīng)刺激”（3,124個(gè)轉(zhuǎn)錄本）和“免疫系統(tǒng)過程”（851個(gè)轉(zhuǎn)錄本）（圖2）。將轉(zhuǎn)錄本與KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，共有16917個(gè)轉(zhuǎn)錄本富集到271個(gè)通路。免疫相關(guān)的KEGG通路主要包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（106個(gè)基因）、Toll-like受體信號(hào)通路（51個(gè)基因）、IgA產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)（20個(gè)基因）等。

圖1 中國(guó)花羔紅點(diǎn)鮭肝脾cDNA文庫(kù)Nr注釋

圖2 轉(zhuǎn)錄本GO分類

3、免疫相關(guān)基因驗(yàn)證和鑒定
重新測(cè)序驗(yàn)證了中國(guó)原生淡水花羔紅點(diǎn)鮭C4基因（S.m-C4）的完整ORF，長(zhǎng)度為5160bp，編碼具有1719個(gè)氨基酸(aa)殘基的蛋白質(zhì)。通過兩兩氨基酸序列比較結(jié)果顯示，Salmo salar與中國(guó)花羔紅點(diǎn)鮭的同源性最高(94.4%)，相似度最高(88.3%)。
確認(rèn)了中國(guó)原生淡水花羔紅點(diǎn)鮭TLR5基因(S.m-TLR5)的cDNA序列。長(zhǎng)度為3123 bp，包括207-bp 5’非翻譯區(qū)域(UTR)，?3’-UTR長(zhǎng)度為279 bp，開放閱讀框(ORF) 2640 bp編碼879個(gè)氨基酸(圖4)，S.m-TLR5蛋白理論分子量為100.6 kDa。

圖4 S.M－TLR5的核苷酸和預(yù)測(cè)的氨基酸序列

4、多重序列比對(duì)
多重序列比對(duì)表明，硬骨魚和人的氨基酸高度保守。推導(dǎo)出的S.m-C4蛋白具有α-β連接子序列RXXR(在殘基668-671)和α-γ。連接序列RRXR（殘基1426-1429），其中C4氨基酸鏈被切割成三個(gè)鏈（α，β和γ鏈）。此外，保守的硫酯（GCGEQ）位點(diǎn)也定位在殘基1001至1005（圖5）。預(yù)測(cè)了TLR5由前21個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽和由14個(gè)氨基酸組成的跨膜螺旋。在膜結(jié)合型TLR5的LRR-CT中發(fā)現(xiàn)4個(gè)保守的半胱氨酸殘基，此外，還有9個(gè)蛋白結(jié)合區(qū)。結(jié)果表明，S.m-TLR5蛋白與銀大麻哈魚（91.5％）、大西洋鮭（91.7％）和衰白鮭（89.6％）的同源性較高，與鯉魚（48.1％）和金鯽（48.8％）的同源性較低。

圖5 中國(guó)淡水花羔紅點(diǎn)鮭與其它物種C4氨基酸序列的多重比對(duì)

5、重建系統(tǒng)發(fā)育
為了探究S.m-C4和S.m-TLR5免疫基因在魚類體內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育情況，中國(guó)淡水花羔紅點(diǎn)鮭與另外23條硬骨魚、兩條鯊魚和一條腔棘魚用于C4基因研究。重建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育中，四種鮭魚形魚類組合在一起，具有較高的后驗(yàn)概率（PP）(圖7)。同時(shí)三種鯉形目魚類和兩種鰓形目魚類分別用1.00 PP進(jìn)行分組，形成骨鰾總目分支。這一結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育相一致。硬骨魚分為鰓形目、原鰓形目、鰓形目和棘鰓目四支，其中，兩條鯊魚是外群。

圖7 重建C4基因貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育

6、分子進(jìn)化分析
首先，利用位點(diǎn)模型探討C4基因中是否存在因其不同的分類地位和生存環(huán)境而正向選擇的位點(diǎn)。在模型中，只有M1a-M2a和M7-M8能夠檢測(cè)到正向選擇位點(diǎn)。M7-M8檢測(cè)到PP > 0.95的10個(gè)正向選擇位點(diǎn)，其中9個(gè)位點(diǎn)也被M1a-M2a檢測(cè)到，表明魚C4基因的正向選擇。其次，利用分枝模型來探究這些正向選擇事件是否發(fā)生在特定的魚類譜系上，從而導(dǎo)致現(xiàn)在的魚或者祖先魚類。最后，利用分枝位點(diǎn)模型，在特定的現(xiàn)在和祖先譜系中檢測(cè)了這些位點(diǎn)。對(duì)于C6基因，M7-M8在正選擇壓力下僅檢測(cè)到一個(gè)位點(diǎn)，而花羔紅點(diǎn)斑鮭或其他冷水魚中的分支位點(diǎn)未檢測(cè)到任何正選擇位點(diǎn)（表8）。

表8 魚C4和C6基因的位點(diǎn)、分枝和分枝位點(diǎn)模型試驗(yàn)

7、qPCR驗(yàn)證相對(duì)表達(dá)量
為探討這兩種免疫基因在細(xì)菌侵入的免疫應(yīng)答，采用定量實(shí)時(shí)PCR（qPCR）技術(shù)，觀察注射后96h內(nèi)肝、脾臟相關(guān)基因的表達(dá)。對(duì)于鹽水處理組，即對(duì)照組，S.m-C4基因在研究的所有時(shí)間點(diǎn)肝臟中均無顯著差異（圖9）。對(duì)于嗜水氣單胞菌注射組，即實(shí)驗(yàn)組，肝臟在24小時(shí)有顯著增加（p=0.04），在12小時(shí)和72小時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)峰值，邊緣顯著。在6h、12h、24h和72h，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組有顯著性差異。對(duì)照組脾臟中S.m-C4基因的相對(duì)表達(dá)上下波動(dòng)，8個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間差異不顯著，實(shí)驗(yàn)組脾臟中S.m-C4基因的相對(duì)表達(dá)除72h外，其余時(shí)間點(diǎn)均無差異，與細(xì)菌注射組0 h相比減少59.6%。

圖9 嗜水氣單胞菌或鹽作用肝臟中S.m-C4相對(duì)表達(dá)量

 

結(jié)論

 

1、本研究以細(xì)菌侵染后中國(guó)淡水花羔紅點(diǎn)斑鮭為材料，構(gòu)建了全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)。經(jīng)過質(zhì)量控制，從31,233個(gè)高質(zhì)量轉(zhuǎn)錄本中共獲得27,829個(gè)轉(zhuǎn)錄本，并鑒定出24,541個(gè)開放閱讀框（ORF），其中17,670個(gè)完整。

2、將27,829個(gè)轉(zhuǎn)錄本用于功能富集和分類分析，25,809個(gè)轉(zhuǎn)錄本得到注釋。相對(duì)于適應(yīng)免疫基因，注釋到更多先天免疫相關(guān)基因。參與Toll-like受體信號(hào)通路的基因多于補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)，表明Toll-like受體在細(xì)菌侵染的淡水花羔紅點(diǎn)鮭中發(fā)揮更重要的免疫作用。

3、為驗(yàn)證全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組鑒定基因序列準(zhǔn)確性，選擇S.m-C4和S.m-TLR5進(jìn)行重新測(cè)序驗(yàn)證，進(jìn)一步證明測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4、中國(guó)淡水花羔紅點(diǎn)鮭中TLR和補(bǔ)體系統(tǒng)顯著數(shù)量差異，可能是TLR和補(bǔ)體系統(tǒng)進(jìn)化壓力模式的不同所致，以TLR3和TLR5以及C4和C6為代表，它們分別處于純化選擇和正選擇壓力。

 

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PacBio?與?Nanopore?均屬于第三代測(cè)序技術(shù)，擁有超長(zhǎng)讀長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，均可獲得全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本序列：PacBio測(cè)序平臺(tái)打破了二代讀長(zhǎng)短、GC偏好性的壁壘，其平均讀長(zhǎng)更長(zhǎng)、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度更高、分析結(jié)果更準(zhǔn)確，局限在于不能對(duì)轉(zhuǎn)錄本定量分析，需要二代測(cè)序輔助定量；而?Nanopore 讀長(zhǎng)更長(zhǎng)，同時(shí)既可以對(duì)轉(zhuǎn)錄本定性，又可以對(duì)轉(zhuǎn)錄本定量，不需輔助二代，成本低，可以說是科研界的新寵。

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