快速克隆基因（二）

 

Positional cloning 2.0?怎樣避免在基因克隆上花費(fèi)10年？

 

就像Xa21的克隆，圖位克隆一直是基因定位的有效方法，它的關(guān)鍵在于產(chǎn)生高分辨率的作圖群體應(yīng)用于表型鑒定和基因分型，這對(duì)親本和創(chuàng)建合適的群體要求較高。今天，隨著測序技術(shù)、芯片技術(shù)的發(fā)展，開發(fā)出“海量”的SNP標(biāo)記，當(dāng)分子標(biāo)記密度不再是克隆基因中的絆腳石，我們得關(guān)注其它問題并進(jìn)行解決。以下總結(jié)3點(diǎn)：

??加速基因克隆的方法1-縮短群體構(gòu)建時(shí)長

針對(duì)這個(gè)問題，作者總結(jié)出以下幾點(diǎn)：

第一：構(gòu)建DH系，由單倍體加倍獲得的雙單倍體，可直接用于育種，極大地縮短育種周期。

第二：Speed breeding，它是一種縮短作物生長周期方法，采用了22:2小時(shí)的光：暗循環(huán)實(shí)現(xiàn)了大麥、小麥、豌豆等一年6代的生長繁殖，對(duì)油菜每年可增長至4代。近日，Nature Protocol發(fā)表了題為”Speed breeding in growth chambers andglasshouses for cropbreeding and model plant research”的研究論文，作者從光強(qiáng)、濕度、溫度及光周期等條件闡述了溫室中加速育種的方法，包括小麥、大麥、硬粒小麥、燕麥、蕓苔屬植物、豌豆、草豌豆、鷹嘴豆、二穗短柄草和藜麥等的快速生長的條件。

將DH系和Speed breeding相結(jié)合可大大縮減構(gòu)建群體的周期。

??加速基因克隆的方法2-候選區(qū)段基因組裝

一旦將基因定位至一段遺傳區(qū)間內(nèi)，此時(shí)會(huì)涉及到遺傳距離向物理距離，CM向bp的轉(zhuǎn)化，這也是圖位克隆的限速步驟，在大基因材料中表現(xiàn)的更明顯，此前它涉及了多輪BAC文庫篩選，例如，小麥中數(shù)百個(gè)基因抗病基因被定位，而只有幾十個(gè)被克隆。每個(gè)BAC克隆含有100-200 kb的DNA，這樣，覆蓋小麥基因組需要500,000個(gè)BAC克隆，且三個(gè)高相似度的基因組為對(duì)我們的篩選進(jìn)行干擾，高質(zhì)量的參考基因組可部分克服這種困難，仍存在由于BAC克隆所含片段大小的限制，圖位克隆已100-200 kb的速度步移著。如何解決這個(gè)問題？

2017年Thind提出了‘Targeted chromosome-based cloning via long-range assembly’(TACCA)的方法，利用Illumina測序得到的短片段序列，對(duì)其組裝，比較片段差異。利用此方法，成功在小麥中克隆了小麥抗葉銹病基因Lr22a。

而Illumina讀長短，百邁客引入ONT?測序（OxfordNanopore Technologies，簡稱ONT）平臺(tái)，部分項(xiàng)目的結(jié)果中，平均reads長度幾乎均在20Kb以上（不同樣品DNA抽提難易程度不同，會(huì)造成一定的影響），最長readsN50高達(dá)48.3 Kb，最長Reads更是高達(dá)1.29 Mb！這為后期不用組裝，直接檢測定位區(qū)間內(nèi)的變異提供可能。

??加速基因克隆的方法3-突變體創(chuàng)造

目前，研究單個(gè)基因和單個(gè)基因效應(yīng)常用方法有誘導(dǎo)突變，DNA誘變劑包括物理誘變與化學(xué)誘變。跳躍基因，T-DNA的發(fā)現(xiàn)也為創(chuàng)造突變體提供新的方法。而人工誘變相較于自然突變有如下優(yōu)點(diǎn)：1、變異豐富，原則上可在基因的任何部位發(fā)生突變；2、單基因隱性突變體可直接研究表型與基因型的關(guān)系，從而排除背景基因?qū)ζ溆绊懀?、絕大多數(shù)誘變植物與未處理植物之間的表型變化由誘變基因控制。

TILLING，即Targeting Induced Local Lesions IN Genomes（定向誘導(dǎo)基因組局部突變技術(shù)），是由Steven Henikoff領(lǐng)導(dǎo)的研究小組發(fā)展起來的，TILLING技術(shù)借助高通量的檢測手段，快速有效地從由化學(xué)誘變劑(EMS)誘變過的突變?nèi)后w中鑒定出點(diǎn)突變。目前此技術(shù)廣泛應(yīng)用于作物研究中，另外還有基因全基因組重測序的MutMap和MutMap +方法，實(shí)現(xiàn)功能基因的快速定位。MutRenSeq和MutChromSeq也應(yīng)用于突變基因定位，2016年John Innes Centre組織利用EMS誘變產(chǎn)生的小麥突變體，使用液相捕獲技術(shù)，通過特異性的RNA捕獲探針對(duì)目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行富集，二代測序后，通過比對(duì)野生型和抗性突變體的序列，找到了目標(biāo)抗性基因。MutChromSeq在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，利用流式細(xì)胞儀技術(shù)將含目標(biāo)基因的單條染色體分離出來，后期結(jié)合高通量測序，通過比較突變體及野生型的差異，快速克隆基因，此方法大大降低重測序的難度，減少了其它染色體序列對(duì)目標(biāo)序列的影響。

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