外泌體小RNA測(cè)序揭示成肌細(xì)胞外泌體促進(jìn)成骨分化【成功案例】

C2C12成肌細(xì)胞外泌體通過(guò)miR-27a-3p促進(jìn)前成骨細(xì)胞MC3T3-E1成骨分化

研究背景

越來(lái)越多的證據(jù)表明，骨與肌肉組織可以影響葡萄糖、能量等代謝。最近，已有報(bào)道骨骼和肌肉也可以通過(guò)內(nèi)分泌方式相互調(diào)節(jié)。并且已確定了一系列參與相互調(diào)節(jié)的肌肉或骨骼調(diào)節(jié)劑。關(guān)于影響骨形成的候選肌因子（myokines ），胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（FGF-2）、骨甘氨酸、FAM5家族、白細(xì)胞介素-7（IL-7）、IL-5、鳶尾素、卵泡抑素、骨粘連蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）作為成骨促進(jìn)劑，而肌抑素、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、激活素、IL-6、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（CNTF）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）作為抑制劑，都屬于分泌蛋白。

外泌體是由包括肌肉細(xì)胞在內(nèi)的大多數(shù)細(xì)胞分泌的小囊泡。最近的研究表明，外泌體在細(xì)胞通訊中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過(guò)轉(zhuǎn)移生物活性分子（蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、microRNA）來(lái)調(diào)節(jié)同質(zhì)和異質(zhì)受體細(xì)胞的功能和分化。例如，作者前期研究表明，成骨細(xì)胞衍生的外泌體可以將microRNA載入間充質(zhì)干細(xì)胞，并通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路促進(jìn)靶細(xì)胞的成骨。

考慮到外泌體在細(xì)胞通訊中的作用，作者推測(cè)外泌體microRNAs是否也可以作為調(diào)節(jié)骨代謝的特殊“肌細(xì)胞因子”。在這項(xiàng)研究中，作者首次提供體外研究證據(jù)，證明成肌細(xì)胞衍生的外泌體可以進(jìn)入成骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。此外表明miR-27a-3p是這種效應(yīng)的關(guān)鍵外泌體成分。

研究方法

• 細(xì)胞培養(yǎng)與成骨誘導(dǎo)分化：小鼠C2C12細(xì)胞培養(yǎng)富集外泌體，MC3T3-E1被誘導(dǎo)骨分化。
• 外泌體富集及miRNA-seq：C2C12細(xì)胞外泌體富集，進(jìn)行miRNA-seq（n=4）。
• 外泌體標(biāo)記與MC3T3-E1細(xì)胞共孵育：觀察攝入現(xiàn)象。
• 敲低C2C12中 miR-27a-3p表達(dá)，進(jìn)行RT-PCR定量。
• RT-PCR定量成骨分化標(biāo)記基因，ALP（堿性磷酸酶）活性測(cè)量和茜素紅染色。
• MC3T3-E1 Western blot及免疫熒光：驗(yàn)證APC及β-catenin活化。

研究結(jié)果

1、C2C12成肌細(xì)胞分泌的外泌體可以進(jìn)入前成骨細(xì)胞MC3T3-E1，促進(jìn)其成骨分化。

將外泌體標(biāo)記與MC3T3-E1共孵育，觀察到這類(lèi)外泌體（myo-exosomes）能夠被MC3T3-E1細(xì)胞攝入。并且MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化也能夠被促進(jìn)，表現(xiàn)為增強(qiáng)的ALP活性，基質(zhì)礦化增強(qiáng)，與標(biāo)記基因ALP/OCN/RUNX2表達(dá)上調(diào)。對(duì)C2C12成肌細(xì)胞分泌的外泌體進(jìn)行小RNA測(cè)序，基于測(cè)序結(jié)果，鑒定出來(lái)的miRNA進(jìn)行共有分析，其中有12個(gè)miRNA分子高表達(dá)，一些功能被證實(shí)的與成骨相關(guān)的miRNA分子，例如miR-27a-3p也包括在內(nèi)。

2、外泌體的miR-27a-3p在成骨分化中發(fā)揮重要作用。

當(dāng)MC3T3-E1細(xì)胞攝入C2C12外泌體后，miR-27a-3p的表達(dá)水平升高。進(jìn)一步敲低miR-27a-3p的表達(dá)，C2C12外泌體沒(méi)有起到促進(jìn)MC3T3-E1成骨分化的作用。這一結(jié)果表明了成肌細(xì)胞外泌體依賴(lài)于miR-27a-3p發(fā)揮促成骨作用。

3、C2C12外泌體改變 MC3T3-E1細(xì)胞中miR-27a-3p的表達(dá)，靶向APC從而激活Wnt/β-catenin pathway。

在成骨分化過(guò)程中，Wnt/β-catenin pathway起到重要作用，APC作為該通路的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白已被證實(shí)直接受miR-27a-3p調(diào)控。MC3T3-E1攝入外泌體后，APC的表達(dá)受到明顯抑制，β-catenin的表達(dá)顯著升高且被激活。當(dāng)miR-27a-3p敲低后，外泌體對(duì)APC-β-catenin pathway沒(méi)有影響。

總結(jié)

成肌細(xì)胞外泌體可以進(jìn)入前成骨細(xì)胞，并促進(jìn)成骨分化。該效應(yīng)依賴(lài)于外泌體中的miR-27a-3p釋放，隨之引起前成骨細(xì)胞中的β-catenin通路活化。文章研究對(duì)肌因子調(diào)控肌肉-骨互作提供了新見(jiàn)解，并且強(qiáng)調(diào)了成肌細(xì)胞外泌體miR-27a-3p作為肌肉相關(guān)的異常骨重建的指標(biāo)和互作靶標(biāo)的可能性。

參考文獻(xiàn)：

Xu Q, Cui Y , Luan J , et al. Exosomes from C2C12 myoblasts enhance osteogenic differentiation of MC3T3-E1 pre-osteoblasts by delivering miR-27a-3p. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2018.

 

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