LncRNA研究熱點 | RNA-seq揭示新反義lncRNA的致癌作用

 

研究背景

NATs（Natural Antisense Transcripts，天然反義轉(zhuǎn)錄本），已報道可以順式調(diào)控正義鏈基因的表達水平，增強或抑制局部水平的轉(zhuǎn)錄，或調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性，招募mRNA活化多核糖體翻譯，也可以遠距離反式調(diào)節(jié)其他基因的表達。

許多l(xiāng)ncRNA作用被陸續(xù)報道，尤其是在癌癥進展方面。例如反義轉(zhuǎn)錄本ZEB2-AS（ zinc finger Ebox binding homeobox 2），調(diào)節(jié)正義鏈基因ZEB2的可變剪接。ZEB2-AS與ZEB mRNA的5’UTR的結(jié)合阻止了正確的剪接發(fā)生，導致內(nèi)含子保留。該事件增加了ZEB mRNA的翻譯效率，導致癌細胞的增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移增強。在其他情況下，作為黑素瘤中的SAMMSON，lncRNA的敲低顯示出有效的抗腫瘤發(fā)生活性，表明這類ncRNA在癌癥治療中是有希望的候選藥物靶標。因此，鑒定癌癥相關的lncRNA增強了對癌癥生物學以及隨后的腫瘤診斷和治療的認知。

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌相關癌癥，約占所有腫瘤的4％。其發(fā)病率在過去三十年中增加了3倍。大多數(shù)甲狀腺腫瘤是分化形式，即乳突狀（PTC，75-80％）。PTC共有的遺傳變異，其中包括相互排斥的激活BRAF和RAS（H-，K-和NRAS）突變 – 分別占40-60％和10-15％的病例 – 和RET重排（RET / PTC癌基因）在約20％的病例（Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology）中描述。癌癥基因組圖譜（ The Cancer Genome Atlas Consortium）的大規(guī)模研究和作者的獨立分析發(fā)現(xiàn)，攜有BRAF基因（特別是_V600E）的體細胞突變或RET癌基因（RET / PTC）重排的PTC具有高度重疊表達模式，這種同質(zhì)亞組患者（定義為BRAF樣）與RAS突變或高度相似（RAS樣）的腫瘤樣本相比具有明顯不同的特征。

作者基于PTC的RNA-Seq數(shù)據(jù)，使用從頭發(fā)現(xiàn)方法來定義BRAF和RAS樣特異性lncRNA的表達特征，并鑒定能夠調(diào)節(jié)和/或干擾甲狀腺腫瘤中已知癌癥驅(qū)動基因表達的新候選lncRNA。鑒定了一種新的天然反義COMET（COrrelated-to-MET）lncRNA，其在BRAF樣癌中顯著上調(diào)，并且在相同腫瘤中與MET癌基因表達顯著正相關。該lncRNA被轉(zhuǎn)錄為MET基因座的反義并具有細胞質(zhì)定位。COMET特異性siRNA敲低減少了MET致癌基因以及其他MAPK相關基因的表達，損害BRAF樣甲狀腺癌細胞系的細胞增殖、遷移和侵襲性。因此，作者用數(shù)據(jù)證實了lncRNA在腫瘤中的致癌性，提供了新的lncRNA-COMET的新證據(jù)，其可維持腫瘤細胞的存活和增殖，并有助于甲狀腺乳頭狀癌的MET驅(qū)動的侵襲。

材料和方法

RNA-seq數(shù)據(jù)分析，鑒定新的lncRNA。

Fish、RT-PCR、qPCR、RNAi、存活率及凋亡檢測、克隆形成及增殖檢測、細胞侵襲檢測、Western Blot。

研究結(jié)果

1、基于RNA-seq數(shù)據(jù)鑒定乳突狀甲狀腺癌（PTC）中的新lncRNA?

為了探索PTC中BRAF和RAS樣特異性lncRNA模式，首先在最近發(fā)表的來自22個甲狀腺活組織的RNA-Seq數(shù)據(jù)集中建立了從頭轉(zhuǎn)錄組裝的計算工作流程，定義一個新的PTC模型轉(zhuǎn)錄組。大于200nt低編碼潛能且與已注釋基因位點無重疊的轉(zhuǎn)錄本鑒定出454個新的lncRNA。與蛋白質(zhì)編碼基因類似，已知和新發(fā)現(xiàn)的lncRNA在患者和對照之間具有顯著差異的表達水平（FDR <0.05）。202個lncRNAs的表達在BRAF和RAS樣PTC之間存在顯著差異（其中77個在BRAF樣PTC中過表達，125個低表達），其中60個未在公共數(shù)據(jù)庫中注釋（圖1D和1E;FDR <0.05）。因此，為鑒定尚未注釋的lncRNAs ：i）在PTC中異常表達，ii）在BRAF-和RAS樣亞組之間差異表達，iii）在附近定位和iv）與已知癌癥驅(qū)動基因高度相關，作者使用“最近轉(zhuǎn)錄起始位點”（TSS）方法選擇mRNAs / lncRNAs對。有趣的是，基于這些標準，將COMET（COrrelated-to-MET）鑒定為新的lncRNA，與MET癌基因正相關（r = 0.7）。

2、COMET：一種新反義lncRNA，在BRAF樣腫瘤中高表達，且由MAPK誘導的細胞質(zhì)lncRNA?

COMET lncRNA比對到染色體7q31.2，且由MET致癌基因的反義鏈轉(zhuǎn)錄而來（圖2A），一般認知lncRNA具有低表達，RNA-Seq數(shù)據(jù)顯示COMET表達顯著低于鄰近的MET癌基因。此外，RNA-Seq還顯示它們都在PTC的BRAF樣亞組中過表達（圖2B），表明Ret和B-Raf蛋白的病理性過度激活有助于它們增加的表達水平。為了證實這一發(fā)現(xiàn)，根據(jù)常見的體細胞突變（BRAF_V600E，H-，K-和N-RAS在密碼子12,13和61的突變）和RET基因重排對以前工作中的一組更大的獨立樣本（腫瘤n = 50;健康n = 11）分類成BRAF樣（n = 32）和RAS樣（n = 18）亞組。在該獨立隊列中，通過qPCR確認NAT lncRNA COMET及其鄰近癌基因MET在BRAF-與RAS樣PTC和對照樣品中過表達（圖2C）。同樣，分析了甲狀腺癌的公共TCGA外顯子組數(shù)據(jù)（THCA; n = 507），并根據(jù)驅(qū)動基因改變對患者進行了分類。然后分析了這些患者的RNASeq數(shù)據(jù)，甚至在這個獨立且更大的PTC隊列中證實了作者的發(fā)現(xiàn)。

為了驗證COMET表達作為Ret和B-Raf蛋白組成型激活的下游轉(zhuǎn)錄事件，檢測了攜帶BRAF_V600E突變（BCPAP）或RET基因重排（TPC-1）的PTC細胞系中的COMET水平與永生化正常甲狀腺細胞系（Nthy-ori 3-1）的比較 。正如所料，COMET以及MET在BRAF樣細胞系中的表達顯著高于正常細胞（圖3A）; 顯示最高COMET表達水平的TPC-1細胞系用作下一步大多數(shù)表型測定的體外模型。

BRAF樣PTC的特征在于ERK介導的轉(zhuǎn)錄程序的過度激活。這一點促使研究COMET表達是否在MAPK激活下游被誘導。因此，用表皮生長因子（EGF）刺激Nthy-ori 3-1細胞中的RAS-RAF-MEK-ERK途徑。MAPK途徑的誘導 – 通過早期p-Erk增加證實（圖3B，右圖） – 隨后COMET水平顯著增加（圖3B，左圖）。相反，使用化學和遺傳方法抑制BRAF突變的BCPAP細胞系中的組成型活性途徑，通過用vemurafenib阻斷過度活化的B-Raf蛋白（圖3C）或BRAF基因KD（圖3D），顯著降低COMET水平。之后評估了COMET細胞定位，與qPCR偶聯(lián)的RNA分級分析顯示，與內(nèi)參蛋白質(zhì)編碼基因（GAPDH）類似，COMET在細胞質(zhì)RNA部分中具有明顯富集（圖3G）。此外，RNA FISH進一步證實了這種新的NAT lncRNA的細胞質(zhì)定位（圖3H）。

3、COMET lncRNA敲低可以削弱癌基因的表達?

為了預測COMET的功能并確定其在乳頭狀甲狀腺癌中的潛在生物學意義，基于共犯原則進行分析。利用基于TCGA的lncRNA圖譜TANRIC，使用Pearson相關性評估甲狀腺癌樣本中的COMET表達是否與其他基因的表達相關。與初步發(fā)現(xiàn)一致，用鄰近癌基因MET檢測出最高相關值（r = 0.88）。此外，對與COMET顯著相關（FDR <0.05;r≥0.7）的基因進行的通路分析顯示MAPK通路的富集，并且有趣的是，其中一些在來自TCGA的PTC樣品的BRAF樣群中過表達（ 圖4A）。

為進一步闡述新的lncRNA與共表達網(wǎng)絡內(nèi)的其他基因之間的功能關系，在BRAF樣腫瘤細胞中敲低了COMET，并檢測表達水平。如圖4B所示，COMET KD顯著損害網(wǎng)絡中大多數(shù)基因的表達水平，尤其是AKT3，CREB5和DUSP5。檢測出COMET?KD后MET mRNA和蛋白質(zhì)水平的顯著下降（圖4C）。為了避免由于siRNA對MET表達的脫靶活性引起的任何潛在的混雜效應，用相同的COMET特異性siRNA庫評估了轉(zhuǎn)染HEK293細胞系的沉默特異性，其表達MET但不表達COMET 。在COMET KD后沒有檢測出該細胞系中MET癌基因水平的變化，表明COMET特異性siRNA不影響MET癌基因水平。進一步測試了是否可能發(fā)生相互調(diào)節(jié)，即MET KD是否會影響COMET和屬于COMET共表達網(wǎng)絡的其他基因的水平。值得注意的是，在TPC-1細胞中敲低MET（高達80％），沒有檢測出COMET水平以及COMET相關基因的任何顯著變化（圖4B），表明COMET 敲低后觀察到的基因表達水平降低與MET無關。

此外，為了探索COMET lncRNA及其鄰近癌基因MET的共調(diào)控，評估了MET誘導刺激是否也能觸發(fā)COMET lncRNA表達。因此，關注了已知誘導MET表達的兩種刺激，即缺氧和肝細胞生長因子（HGF）治療。與在常氧條件下生長的細胞相比，在低氧條件下生長的TPC-1顯示COMET水平增加2倍（圖4D），揭示缺氧介導的轉(zhuǎn)錄反應也影響COMET表達。同樣，用膜c-Met受體配體HGF急性刺激Nthy-ori 3-1也誘導COMET lncRNA水平的增加（圖4E）。值得注意的是，用HGF處理也誘導FOSL2表達，進一步表明其在COMET調(diào)節(jié)中的作用。

4、COMET 敲低抑制細胞增殖和誘導凋亡，且COMET沉默影響甲狀腺癌細胞的侵襲遷移。并在體外評估了COMET靶向治療的潛力?

由于COMET KD引起c-Met水平的相關下降，以及甲狀腺癌細胞中其他MAPK相關癌基因表達水平的顯著降低，進一步研究了COMET KD對腫瘤細胞的表型效應。為此在不同時間點測量了COMET KD后TPC-1細胞系的細胞活力和增殖能力。有趣的是，與對照無關轉(zhuǎn)染的細胞相比，COMET-KD活細胞的百分比顯著降低至~40％（在72小時）（圖5A）。通過細胞增殖測定檢測COMET-KD顯著降低細胞增殖（圖5B）。此外，為了進一步了解COMET如何調(diào)節(jié)甲狀腺癌細胞的細胞生長，通過測量半胱天冬酶3和7的活性驗證了COMET KD是否能夠誘導細胞凋亡。如圖5C所示，沉默24小時后COMET KD顯著增加凋亡TPC的數(shù)量 。最后，為了驗證COMET KD是否在體外影響甲狀腺腫瘤細胞的致瘤潛力，檢測了COMET-KD TPC-1和對照細胞的克隆形成能力。如圖5D所示，在菌落的數(shù)量和大小方面，COMET沉默顯著影響甲狀腺癌細胞的致癌能力。

考慮到COMET沉默對c-Met蛋白的影響以及在腫瘤侵襲性生長過程中的主要作用，進一步探討了COMET KD對甲狀腺癌細胞遷移和侵襲性的影響。如圖6A和6B所示，COMET敲低（高達40％）顯著降低TPC-1細胞的遷移和侵襲能力。因此，在COMET KD腫瘤細胞中顯示出上皮 – 間充質(zhì)轉(zhuǎn)換（EMT）標記波形蛋白（mRNA和蛋白質(zhì)）的顯著較低表達，而沒有任何N-鈣粘蛋白表達的變化（圖6C）。總之，這些數(shù)據(jù)支持甲狀腺中新鑒定的COMET lncRNA的體外致癌作用，極具表明這種性質(zhì)至少部分地依賴于其對MET和MAPK相關癌基因表達水平的調(diào)節(jié)活性。

據(jù)報道，受體酪氨酸激酶（RTK），特別是c-Met受體的激活是腫瘤細胞逃避vemurafenib（VMR，維莫非尼）介導的突變體B-Raf蛋白抑制的機制。由于作者數(shù)據(jù)支持COMET可作為MET新的調(diào)節(jié)劑，猜測它是否也可能作用于BRAF突變的腫瘤細胞中的vemurafenib反應機制。首先，與TPC-1細胞類似，評估COMET沉默對BRAF_V600E突變的BCPAP細胞系的生存力（高達50％）具有強烈影響（圖6D），伴隨MET水平的下降。當用VMR處理BCPAP時，也表現(xiàn)出了類似的效果（高達60％的細胞存活率降低）。因此，將敲低COMET的BCPAP細胞暴露于VMR，以評估組合治療是否可發(fā)揮累加效應。有趣的是，圖6D中數(shù)據(jù)表明，與對照細胞（即僅用VMR處理和/或用對照siRNA轉(zhuǎn)染的細胞，圖6D）相比，COMET敲低的 BCPAP細胞具有顯著增強的VMR敏感性，表明在BRAF_V600E突變腫瘤中COMET是提高化療的新靶標。

小結(jié)

文章使用de novo發(fā)現(xiàn)方法分析RNA測序數(shù)據(jù)，鑒定lncRNA并定義注釋的lncRNA在腫瘤亞型中的特異性。其中，鑒定了COMET（COrrelated-to-MET），一種天然反義轉(zhuǎn)錄物，在含有BRAF_V600E突變或RET基因重排（即BRAF樣腫瘤）的癌癥中高表達，并誘導下游絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑。在乳頭狀甲狀腺癌中，COMET表達與MET表達高度相關，且與MAPK途徑的不同致癌基因共表達。COMET的降低導致該網(wǎng)絡內(nèi)基因的表達降低，包括MET癌基因。COMET沉默抑制了攜帶BRAF_V600E體細胞突變或RET癌基因重排的腫瘤細胞的活力和增殖，并顯著降低了腫瘤細胞的運動性和侵襲性。此外，COMET的沉默顯著增加了對vemurafenib（一種突變的B-raf的常見抑制劑）的敏感性。總的來說，研究結(jié)果表明COMET特別是在BRAF突變和MET誘導的乳頭狀甲狀腺癌中可作為一種基于藥物改善癌癥治療的新靶點。

參考文獻

Esposito R, Esposito D, et al. Oncogenic properties of the antisense lncRNA COMET in BRAF- and RET-driven papillary thyroid carcinomas.Cancer Research,2019.

 

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