三代重測(cè)序助力阿爾茲海默癥研究

2019年3月在Acta Neuropathologica雜志（IF=15.87）發(fā)表了一篇Loss of DPP6 in neurodegenerative dementia: a genetic player in the dysfunction of neuronal excitability 文章。簡(jiǎn)單一句話介紹就是，作者采用二代和三代Nanopore重測(cè)序數(shù)據(jù)找到了DPP6上的4M大小的倒位，并采用二代測(cè)序數(shù)據(jù)大隊(duì)列研究DPP6基因的變異對(duì)阿爾茲海默癥的影響。

摘要

新出現(xiàn)的證據(jù)表明，神經(jīng)退行性腦疾病(NBD)中存在一種匯聚機(jī)制，早期神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)功能障礙和神經(jīng)穩(wěn)態(tài)的改變，這些都是神經(jīng)退行性疾病的罪魁禍?zhǔn)?。本研究中，作者采用二代測(cè)序和三代長(zhǎng)read全基因組測(cè)序來(lái)研究常染色體顯性遺傳史的癡呆家族顯著關(guān)聯(lián)的7q36。他們識(shí)別并驗(yàn)證了4Mb的倒位在疾病單倍型中分離，并擾亂了DPP6基因的編碼序列。在早發(fā)性阿爾茲海默癥和額顳葉癡呆中，利用DPP6基因的重測(cè)序技術(shù)識(shí)別了更多罕見(jiàn)的非同義突變，移碼突變和無(wú)義突變。

DPP6是一個(gè)II型跨膜蛋白，有著高度結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外的結(jié)構(gòu)域，并且主要在腦中表達(dá)。DPP6與鉀通道K_v4.2形成多聚體復(fù)合物，調(diào)節(jié)腦中電壓依賴性門控特性。K_v4.2在大腦中的表達(dá)在神經(jīng)元興奮性中起關(guān)鍵作用。體外模擬發(fā)現(xiàn)患者的無(wú)義突變會(huì)改變DPP6，并降低薄膜表達(dá)進(jìn)而導(dǎo)致蛋白的缺失。在無(wú)義突變攜帶者上可以檢測(cè)到DPP6和K_v4.2表達(dá)降低。同時(shí)DPP6的缺失會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)過(guò)度興奮，敲除Dpp6的小鼠的行為會(huì)發(fā)生改變?？偠灾?，DPP6作為癡呆研究中的新基因，能夠加強(qiáng)神經(jīng)過(guò)度興奮，并能改變神經(jīng)細(xì)胞啟動(dòng)的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

測(cè)序方法

二代重測(cè)序：4個(gè)1270患病家族中第三代的子女；

三代重測(cè)序：上述4個(gè)樣品中的patient III-48以及10名無(wú)關(guān)癡呆患者和對(duì)照組樣品，采用牛津納米孔公司（Oxford?Nanopore?Technologies，簡(jiǎn)稱ONT）的高通量測(cè)序平臺(tái)PromethION測(cè)序儀進(jìn)行長(zhǎng)read基因組測(cè)序，首先用Megaruptor 將DNA被打斷成35Kb，并采用BluePippin 選擇最短6kb的片段進(jìn)行文庫(kù)制備和測(cè)序；

DPP6基因重測(cè)序：對(duì)558個(gè)早發(fā)性阿爾茲海默癥患者（EOAD，平均發(fā)病年齡61.6±6.8）和614個(gè)額顳葉癡呆患者（FTD，平均發(fā)病年齡66.1±9.9），采用Illumina公司 Miseq測(cè)序儀對(duì)DPP6基因完整的編碼區(qū)域重測(cè)序。

分析結(jié)果

1270家族的二代測(cè)序結(jié)果

先前對(duì)1270家族的7q36的遺傳分析識(shí)別了五個(gè)不同基因（ABCF2, GALNT11, DPP6, PAXIP1, EN2 ）的七個(gè)變異，且在1270家族的疾病單倍型中是分離的。大多數(shù)這些變異是同義突變，并且只有PAXIP1 p.A660變異在對(duì)照個(gè)體中是缺失的。目前公開(kāi)的基因數(shù)據(jù)（如ExAc）顯示，PAXIP1存在不同的核苷酸變化，導(dǎo)致同樣的沉默突變（p.A660），這使得PAXIP1不太可能具有有害影響。此外，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PAXIP1在患者淋巴母細(xì)胞中異常剪接的證據(jù)。

對(duì)1270家族的第三代4個(gè)患病的兄弟姐妹（III-12，III-38，III-41，III-48）進(jìn)行WGS測(cè)序。選擇4個(gè)患者共有的注釋的高質(zhì)量的遺傳變異，罕見(jiàn)的（千人基因組計(jì)劃中<1%）或者雜合的非編碼變異進(jìn)行后續(xù)研究。在STR標(biāo)記D7S636和D7S559上連鎖區(qū)域的位點(diǎn)保留了79個(gè)非編碼的變異。驗(yàn)證和分離分析保留了38個(gè)非編碼變異，這些變異在1270家族的疾病單倍型中共分離。對(duì)照個(gè)體中的變異的基因型顯示4個(gè)變異對(duì)于1270家族是唯一的。其中3個(gè)變異均位于DPP6基因的1號(hào)內(nèi)含子上，另一個(gè)變異位于基因間區(qū)（距SHH基因最近，27.3Kb）距離DPP6基因下游908kb。而這四個(gè)變異在ENCODE注釋都不具有潛在的高度破壞性。

注：共分離是指在有性繁殖的后代，假如基因附近有一緊密連鎖的分子標(biāo)記，在細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)分子標(biāo)記與基因之間由于相距太近很少有機(jī)會(huì)發(fā)生交換，那么這種分子標(biāo)記與連鎖的基因有最大的可能同時(shí)出現(xiàn)在同一個(gè)個(gè)體中。

為了排除是連鎖區(qū)域外的編碼變異引起的疾病，作者提取了WGS數(shù)據(jù)的外顯子，并且分析了罕見(jiàn)的及新的編碼非同義變異。選擇四個(gè)患者共有的雜合變異（UTRs，同義和非同義）。只驗(yàn)證了出現(xiàn)在已知的蛋白編碼基因的罕見(jiàn)或者新的變異。這個(gè)選擇產(chǎn)生了9個(gè)非同義突變，如下表，但卻在1270家族中沒(méi)有與疾病共分離。

連鎖7q36區(qū)域存在4Mb的反轉(zhuǎn)破壞了DPP6序列

作者設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增連鎖區(qū)域去證實(shí)這些變異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物在兩個(gè)7號(hào)染色體的位點(diǎn)比對(duì)到了相反的方向，且距離將近4Mb。7號(hào)染色體上的局部比對(duì)，證實(shí)了反向雜合低拷貝重復(fù)的出現(xiàn)。遠(yuǎn)端的斷點(diǎn)位于7q36.2連鎖區(qū)域上，DPP6基因的1號(hào)內(nèi)含子上，被預(yù)測(cè)改變了基因的編碼序列；臨近的倒位斷點(diǎn)位于連鎖區(qū)域之外。

作者對(duì)III-48號(hào)樣品進(jìn)行三代測(cè)序去驗(yàn)證前面推測(cè)的結(jié)果。作者采用PromethION測(cè)序?qū)II-48號(hào)患者進(jìn)行測(cè)序，約6X覆蓋度，得到21.2G數(shù)據(jù)。在七號(hào)染色體的149,704,610–153,786,893區(qū)域發(fā)現(xiàn)了倒位。而這個(gè)7q36.2倒位（在DPP6基因的1號(hào)內(nèi)含子上存在斷點(diǎn)），卻沒(méi)有在先前的209個(gè)無(wú)關(guān)個(gè)體的二代WGS數(shù)據(jù)中被發(fā)現(xiàn)。同時(shí)用三代ONT平臺(tái)產(chǎn)生的10個(gè)癡呆患者和對(duì)照患者也都沒(méi)有出現(xiàn)這個(gè)倒位。

DPP6上的罕見(jiàn)變異與神經(jīng)退行性癡呆相關(guān)

為了更好的理解DPP6對(duì)于退行性癡呆(NBD)的遺傳貢獻(xiàn)，作者對(duì)558個(gè)早發(fā)性阿爾茲海默癥（EOAD）和614個(gè)額顳葉癡呆患者（FTD）的DPP6編碼外顯子進(jìn)行測(cè)序并識(shí)別罕見(jiàn)的蛋白改變的變異。在2個(gè)FTD患者中識(shí)別到兩個(gè)終止密碼子突變（PTC），p.E79Gfs*9 和p.Q23O* ，且在755個(gè)對(duì)照組中是缺失的。此外，在阿爾茲海默癥（AD），F(xiàn)TD及對(duì)照組的1號(hào)外顯子上識(shí)別到了22個(gè)錯(cuò)義變異以及大小變化的Gly插入/缺失。最后發(fā)現(xiàn)DPP6基因上罕見(jiàn)變異與AD、FTD顯著的關(guān)聯(lián)。

罕見(jiàn)變異改變患者腦組織中DPP6表達(dá)水平

只有3個(gè)攜帶DPP6無(wú)義突變的患者的解剖大腦被凍存。這三個(gè)患者的神經(jīng)病理學(xué)診斷分別是阿爾茲海默癥AD，F(xiàn)TLD-TDP typeD（FTD行為變異和佩吉特氏骨?。?，F(xiàn)TLD-ALS type B（FTD行為變異及球類型）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個(gè)DPP6變異(p.P509R, p.R47L, and p.D596N)?的mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，并且發(fā)現(xiàn)p.P509R和p.R47L 攜帶者的DPP6蛋白表達(dá)水平也顯著下降。

 

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