Direct RNA 測(cè)序丨我們可以做什么？

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已經(jīng)成為研究基因表達(dá)調(diào)控的主要手段。二代測(cè)序技術(shù)通量高，更多的關(guān)注基因表達(dá)量，然其局限性在于測(cè)序讀長(zhǎng)短，轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生拼接錯(cuò)誤，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)不完整。生物體內(nèi)復(fù)雜多變的轉(zhuǎn)錄本是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)多樣性的重要機(jī)制，準(zhǔn)確鑒定轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)，是深入研究基因表達(dá)調(diào)控模式的基礎(chǔ)。

全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組研究可全面快速的獲取有參或無(wú)參物種特定組織或器官在某一狀態(tài)下的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本信息，構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本基因集。相較于RNA-seq，基于Nanopore三代測(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組研究，無(wú)需打斷，直接讀取5’ 端到3’-PolyA的高質(zhì)量完整轉(zhuǎn)錄本，準(zhǔn)確鑒定可變剪接、新基因/新異構(gòu)體、可變多聚腺苷酸化、融合基因等，完善基因組注釋。此外，Nanopore平臺(tái)更擁有Direct RNA測(cè)序方式。

那么，使用Direct RNA測(cè)序技術(shù)，我們能做些什么呢？下面小編帶大家解析一篇新出爐的direc RNA 測(cè)序文章

研究背景

目前絕大多數(shù)的轉(zhuǎn)錄組注釋都是依賴(lài)于cDNA高通量測(cè)序固有的短讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)。線蟲(chóng)的基因組緊湊，注釋良好，細(xì)胞譜系穩(wěn)定，是一種理想的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕?。然而，在秀麗桿線蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組中，大約有超過(guò)一半的轉(zhuǎn)錄本缺少全長(zhǎng)信息的支撐，且依賴(lài)于無(wú)法跨越轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)序列的短reads的預(yù)測(cè)。同時(shí)，利用短讀長(zhǎng)對(duì)polyA和3’UTR進(jìn)行預(yù)測(cè)，并不能直接鑒定到剪接轉(zhuǎn)錄本的起始位點(diǎn)，且在3’UTR鑒定中，依賴(lài)于將推測(cè)的剪接位點(diǎn)分配給最近的重疊或上游基因。相比之下，納米孔測(cè)序沒(méi)有理論上的讀取長(zhǎng)度上限，能夠在單個(gè)分子水平上對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行一端到另一端的測(cè)序。

材料方法

材料：L1、L2、L3、L4、幼年成蟲(chóng)（YA）、成蟲(chóng)，雄性線蟲(chóng)；每個(gè)時(shí)期兩次技術(shù)重復(fù)

方法：20 μg Total RNA，調(diào)取約600ng PolyA RNA；GridION平臺(tái)，direct RNA sequencing

結(jié)果

1、線蟲(chóng)測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本鑒定

選取線蟲(chóng)發(fā)育的L1、L2、L3、L4、幼年成蟲(chóng)（YA）和成蟲(chóng)時(shí)期，以及雄性成蟲(chóng)，其中幼年成蟲(chóng)和成蟲(chóng)雌雄同體，對(duì)其進(jìn)行direct RNA測(cè)序，每個(gè)時(shí)期兩個(gè)技術(shù)重復(fù)。共計(jì)獲得5.54M reads，其平均長(zhǎng)度為739到934 bp，基因組比對(duì)率為87.8%。

通過(guò)一系列的篩選標(biāo)準(zhǔn)，最終共計(jì)獲得2.9M 全長(zhǎng)reads。綜合所有階段，最終鑒定到25,944 個(gè)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，其中20,987個(gè)轉(zhuǎn)錄本有唯一的可變剪接形式，16,325個(gè)轉(zhuǎn)錄本有唯一的3’UTRs ，平均每個(gè)階段鑒定到超過(guò)12,000條全長(zhǎng)序列。在和線蟲(chóng)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋比對(duì)后，有12,613 轉(zhuǎn)錄本和10,711 個(gè)基因有全長(zhǎng)數(shù)據(jù)支持，此外還鑒定到4,234個(gè)新基因和7,404 個(gè)新轉(zhuǎn)錄本。其中，發(fā)現(xiàn)9,900個(gè)已知可變剪接轉(zhuǎn)錄本和2,188個(gè)新的可變剪接轉(zhuǎn)錄本，對(duì)應(yīng)1,349個(gè)基因。在這些新的剪接轉(zhuǎn)錄本中，有1,283個(gè)轉(zhuǎn)錄本在注釋的供體和受體剪接位點(diǎn)之間存在新的剪接位點(diǎn)，同時(shí)173個(gè)轉(zhuǎn)錄本還存在新的外顯子。

圖一 全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本測(cè)序概述

2、3’UTR鑒定

本文共鑒定到16,325個(gè)唯一的3’UTR轉(zhuǎn)錄本，在每個(gè)階段均鑒定到超過(guò)10,000 個(gè)3’UTRs。將鑒定到的3’?UTR與已知數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)共有82.9% UTRs的重疊。此外，還鑒定到2,304個(gè)新的發(fā)現(xiàn)的3’?UTR。3’?UTR的長(zhǎng)度會(huì)隨著階段的延續(xù)，從L1到L4，逐漸變短，在成年線蟲(chóng)中，雄性線蟲(chóng)的3’?UTR要短于雌雄同體的成蟲(chóng)，而成蟲(chóng)的 3’?UTR要稍長(zhǎng)于L4階段的成蟲(chóng)，這與前人的報(bào)道相反。通過(guò)不同階段多聚腺苷酸化位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)在不同階段，其位點(diǎn)不存在顯著差異，該結(jié)果表明，不同階段3’?UTR的長(zhǎng)度分布與多聚腺苷化位點(diǎn)無(wú)關(guān)。

?圖二?3’?UTR特征統(tǒng)計(jì)

3、PolyA尾預(yù)測(cè)

研究表明，在黑腹果蠅中，polyA尾的長(zhǎng)度會(huì)隨著發(fā)育階段而呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化。而在本文中，通過(guò)對(duì)線蟲(chóng)不同時(shí)期polyA長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)其變化比較穩(wěn)定，在幼蟲(chóng)發(fā)育階段，其變化范圍為49nt（L1）到54nt（L2）；在成蟲(chóng)發(fā)育階段（幼年成蟲(chóng)、雌雄同體成蟲(chóng)和雄性成蟲(chóng)），其polyA長(zhǎng)度中位數(shù)為58nt，要長(zhǎng)于幼蟲(chóng)的polyA長(zhǎng)度（52nt）。該結(jié)果表明，在成蟲(chóng)和幼蟲(chóng)之間，polyA的長(zhǎng)度變化最為顯著。將L4階段的polyA長(zhǎng)度分布與前人研究報(bào)道進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其長(zhǎng)度分布非常相似，均在30~40 nt出現(xiàn)峰值，并向較長(zhǎng)的尾部延伸。

PolyA的長(zhǎng)度，有可能和3’?UTR區(qū)域的polyA剪接位點(diǎn)（AAUAAA）有關(guān)。為了證明該推測(cè)，本文對(duì)不同polyA剪接位點(diǎn)類(lèi)型（經(jīng)典的、可變的及無(wú)剪接位點(diǎn)）的polyA尾進(jìn)行了長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)型間存在顯著差異，且3’UTR區(qū)域不存在polyA剪接位點(diǎn)的，具有更長(zhǎng)的polyA尾巴。在3’UTR區(qū)域，無(wú)polyA剪接位點(diǎn)的，其polyA長(zhǎng)度中位數(shù)為58 nt，具有可變polyA剪接位點(diǎn)的，長(zhǎng)度為46 nt；具有經(jīng)典的polyA剪接位點(diǎn)（AAUAAA），其長(zhǎng)度中位數(shù)為48 nt。研究表明，polyA尾的長(zhǎng)度與基因表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，即高表達(dá)的基因具有更短的polyA尾。對(duì)本研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在幼蟲(chóng)發(fā)育階段發(fā)現(xiàn)有相似的負(fù)相關(guān)關(guān)系。例如，Y37E3.8基因的a轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)要顯著高于b.1轉(zhuǎn)錄本，其polyA尾相較于b.1更短。polyA長(zhǎng)度和基因表達(dá)水平的相關(guān)性R²?最高為0.1297。在成蟲(chóng)發(fā)育階段，polyA長(zhǎng)度和基因表達(dá)水平的相關(guān)性并不是很高。該結(jié)果表明，基因表達(dá)水平和polyA尾長(zhǎng)度的負(fù)相關(guān)性具有階段性。最后，本文研究了polyA長(zhǎng)度與內(nèi)含子保留可變剪接事件的相關(guān)性。研究表明，在人類(lèi)細(xì)胞系中，polyA尾的長(zhǎng)度與內(nèi)含子保留有關(guān)。在本文中，也發(fā)現(xiàn)polyA尾和內(nèi)含子保留事件呈現(xiàn)正相關(guān)。該結(jié)果表明，polyA尾在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控存在一種保守機(jī)制，即在核轉(zhuǎn)錄本中，其擁有更長(zhǎng)的polyA尾，而隨著轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的過(guò)程中，polyA尾會(huì)進(jìn)行脫腺苷化而進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后進(jìn)程。

圖三 PolyA 特征統(tǒng)計(jì)

小結(jié)

在本研究中，作者更側(cè)重于關(guān)注全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)分布，并對(duì)其進(jìn)行了詳細(xì)描述。從本研究可以看出，使用Nanopore測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行direct RNA測(cè)序，借助其長(zhǎng)讀長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，可準(zhǔn)確鑒定轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)信息。此外，Nanopore平臺(tái)還擁有cDNA測(cè)序方式（橄欖果蠅胚胎發(fā)育的動(dòng)態(tài)變化解析），多種建庫(kù)方式，可滿足不同的研究需求。

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