通過選擇種皮發(fā)亮性來提高大豆種子油含量【文獻原文下載】

 

研究背景

大豆（Glycine max）是從6000到9000年前的東亞野生親緣大豆中馴化而來，導(dǎo)致了巨大的形態(tài)和生理變化，統(tǒng)稱為“馴養(yǎng)綜合癥”。一些與馴化有關(guān)的性狀（DRT）受一主要QTL控制，并且不同DRT所基于的某些QTL區(qū)域重疊。

許多豆科植物的種皮上都有一層含有致敏性過敏原的泥膜，使得種子不易被看見，為潛在的掠食者提供了雙重保護，保護后代。然而，無泥膜的光澤的種子對于人類消費和健康是有利的，并且是馴化選擇的目標(biāo)。較早的研究提出，三個互補基因B1，B2和B3控制花開發(fā)育，但多項研究僅檢測到13號染色體上的B1基因座。

技術(shù)路線

結(jié)果展示

圖1.?G. max、?G. soja及其子代的種皮光澤

為了確定從開花到無花表型馴化過渡的基礎(chǔ)關(guān)鍵基因，將無花大豆品種Williams 82引入兩個高度不同的開花G. soja品種PI468916和PI 479752，并獲得了由大約3500個RIL組成的兩個F_6：7重組自交系（RIL）群體。以Williams 82作為母本的雜交種子（F₁種子）沒有種皮開花，而衍生自F₁植物的F_1：2種子則具有種皮開花。而來自以Williams 82作為父本的雜交的F₁和F_1：2種子均攜帶種皮開花（圖1b）。兩個RIL群體的兩個子集的表型分析顯示開花與無花表型的比例為1：1。根據(jù)種皮開花與母果莢果內(nèi)果皮觀察表明，兩種種皮開花主要由單個基因控制，并且在表皮上，開花表型為顯性或部分顯性。值得注意的是，開花RIL之間的種皮開花數(shù)量不同，這可能反映了少量QTL調(diào)節(jié)種皮開花積累的影響。

圖2.?B1基因克隆

隨后對RIL的兩個子集進行處理，以通過測序（GBS）進行基因分型?；蛐秃捅硇蛿?shù)據(jù)的組合在PI 468916和PI 479752中在13號染色體上種皮開花的基礎(chǔ)上定義了一個區(qū)域（圖2a），該區(qū)域與先前映射的B1區(qū)域重疊，表明這兩個種質(zhì)由B1基因座控制。在映射區(qū)域內(nèi)的其他標(biāo)記用于鑒定兩個RIL群體中與B1基因座之間的重組體，最后根據(jù)大豆參考基因組序列將B1基因座精細映射到一個包含兩個基因（Glyma.13G241700、Glyma.13G241800）的14.5 kb區(qū)域（圖2b）。對三個親本系的兩個基因進行測序，Williams 82和兩個大豆親本之間的差異只有一個SNP位點，即Glyma13G241700的編碼序列（CDS）中的一個（C到T）點突變，導(dǎo)致氨基酸從半胱氨酸變?yōu)榫彼幔▓D2c）。花后5周，Glyma.13G241700在發(fā)育中的豆莢中最高表達，其在PI 468916和（Williams 82×PI 468916）F1中的表達水平相似，但均明顯高于Williams 82（圖2d）。相比之下，兩個親本中的Glyma.13G241800和F1的表達水平?jīng)]有顯著差異（圖2e）。這些觀察結(jié)果表明，雙親中的Glyma.13G241700最有可能成為B1的候選基因，預(yù)計B1編碼跨膜轉(zhuǎn)運蛋白樣蛋白（圖2f）。

然后將來自PI 4768916的Glyma.13G241700的CDS與花椰菜花葉病毒35S啟動子融合，并將融合構(gòu)建體（p35S：CDS-B1）引入Williams82。兩個獨立轉(zhuǎn)化事件各自獲得約20個T1轉(zhuǎn)基因種子。如圖2g所示，在所有轉(zhuǎn)基因種子的表面均觀察到種皮開花，但在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩袇s沒有，證明Glyma.13G241700是B1基因座。在R5（種子發(fā)育）階段，由35S啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因B1在發(fā)育中的豆莢，豆莢果皮，種皮和種子中的表達水平顯著高于Williams 82中的b1（圖2h），并且在四個組織中的每一個中，轉(zhuǎn)基因B1的表達水平與T_1：2種子的表皮表面積累的泥膜量呈正相關(guān)。

檢查先前重新測序的62個G. soja種質(zhì)和240個G. max種質(zhì)是否存在種皮開花和B1位點的序列變異。發(fā)現(xiàn)2大豆和Williams 82之間B1的CDS內(nèi)（C到T）多態(tài)性與302個種之間種皮開花的表型差異完全相關(guān)（圖2i），提示（C到T）點突變是表型轉(zhuǎn)變的原因。預(yù)計該點突變會導(dǎo)致該基因編碼的蛋白質(zhì)的螺旋結(jié)構(gòu)丟失，而兩個大豆親本之間的另一個SNP（A到G）并未導(dǎo)致該蛋白質(zhì)的任何明顯結(jié)構(gòu)變化（圖2j）。

隨后，將來自PI 468916的B1的CDS和來自Williams 82的b1分別與B1啟動子區(qū)域融合，并將融合的pB1：CDS-B1和pB1：CDS-b1構(gòu)建體引入擬南芥以獲得T2轉(zhuǎn)基因品系。由于擬南芥的種子較小且種子表面粗糙，因此無法清楚地區(qū)分轉(zhuǎn)基因種子與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩g的種子表面紋理。然而，pB1：CDS-B1轉(zhuǎn)基因種子的表面比pB1：CDS-b1轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏谋砻娓n白和暗沉（圖2k）。與G. soja和G. max中的B1 / b1等位基因相似（圖2d），pB1：CDS-B1在擬南芥背景中的表達水平明顯高于pB1：CDS-b1（圖2l）。 B1 / b1之間的C到T多態(tài)性與基因的表達水平有關(guān)。

圖3.?B1基因座對種子油含量的多效性影響

先前通過全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）使用302個重測序種質(zhì)的子集，確定了潛在的主要QTL種子油含量，包括46 個G. soja種質(zhì)和127個 G. max種質(zhì)的種子油含量信息（www.ars-grin.gov/npgs）和一個246 kb 的QTL區(qū)域在35,194,140 bp處達到峰值，位于B1基因座的下游約31 kb處（圖3a）與籽油含量的變化顯著相關(guān)。由于G. soja和G. max的種子油含量差異很大，前者的平均值約為10.9％，后者的平均值約為18.0％，因此認為該油脂QTL為可能是造成栽培大豆種子油含量升高的原因。

由于B1位點和油脂QTL均被定義為一個約410 kb的“馴化”區(qū)域（由大豆馴化形成）（圖3a），想知道這兩個基因座（如果不同）是否通過連鎖同時選擇，或單個基因座是否對這兩個性狀具有多效作用，從美國農(nóng)業(yè)部大豆種質(zhì)資源庫（www.ars.grin.gov/npgs）中選擇全部70個開花的G.max品種和從先前選擇用于調(diào)查GWAS種子油含量的遺傳多樣性的這個收集物中的52個“無花”的G.max品種。利用來自這122個種質(zhì)的全基因組SNP數(shù)據(jù)，檢測到與B1選擇性清除區(qū)域中種皮開花相關(guān)的種子油QTL（圖3b），表明B1基因座可能對種子油含量具有多效性作用。據(jù)推測，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，來自兩個獨立事件的大豆p35S：CDSB1轉(zhuǎn)基因種子均顯示出種子油含量顯著降低（4.5％和6.9％）。種子油含量降低的水平似乎與轉(zhuǎn)基因的表達水平相關(guān)（圖2h）。與pB1：CDS-b1轉(zhuǎn)基因種子或非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾?，擬南芥pB1：CDS-B1轉(zhuǎn)基因種子中的脂肪酸含量也顯著降低，但在pB1：b1-CDS轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩g未檢測到種子油含量的顯著差異（圖3d），表明（C到T）多態(tài)性是表型差異的原因。

圖4.?調(diào)控大豆脂肪酸生物合成的四個轉(zhuǎn)錄因子基因的表達水平和相互作用

為了闡明B1介導(dǎo)降低種子油含量的機制，分析了Williams 82發(fā)育豆莢、豆莢內(nèi)果皮、種皮和種子中四種轉(zhuǎn)錄因子GmWRI1a，GmLEC1a，GmLEC1b和GmABI3b的表達水平。B1和PI 468916的T1轉(zhuǎn)基因植物在R5階段過表達。這些轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)了大豆種子中脂肪酸的生物合成，其表達水平與種子油含量呈正相關(guān)。在B1的過表達下發(fā)育中的豆莢和豆莢果皮中四種轉(zhuǎn)錄因子的表達水平均顯著降低而在發(fā)育中的種皮和種子中未觀察（圖4a）。Williams 82和PI 468916之間的B1 / b1表達模式與之呼應(yīng)（圖4b）。表明B1基因不影響大豆種子中脂肪酸的合成，是通過下調(diào)脂肪酸生物合成影響莢果（圖4c）。

總結(jié)

B1基因座對種皮開花和種子油含量均具有多效性，為進一步分離B1介導(dǎo)的兩個重要種子性狀的基因網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。盡管已經(jīng)在種群水平上對許多植物物種進行了測序和重測序，但有限數(shù)量的馴化相關(guān)基因，其中表型轉(zhuǎn)變的致病性突變已闡明。部分原因可能是由于基因-環(huán)境相互作用和各種基因-等位基因相互作用（包括多效性）決定了馴養(yǎng)綜合征的復(fù)雜性。最近的一項研究表明，在非洲水稻馴化過程中人為選擇SHATTERING 4的無意義突變會導(dǎo)致不破粒但顆粒尺寸較小。多效性并不總是對古代和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有利。