2020年5月，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所陳四清研究員團(tuán)隊(duì)與北京百邁客生物科技有限公司合作完成了超高質(zhì)量的綠鰭?cǎi)R面鲀基因組，相關(guān)研究成果發(fā)表在知名期刊Molecular Ecology Resources上。本次研究基于納米孔測(cè)序技術(shù)（Nanopore）和染色體構(gòu)象捕獲技術(shù)（Hi-C）完成的基因組僅包含242個(gè)Contigs，Contig N50高達(dá)22.46 Mb，并將99.44%序列掛載到20條染色體上，實(shí)現(xiàn)了海洋魚(yú)類基因組組裝質(zhì)量質(zhì)的飛躍！
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占比地球容量71%的海洋中蘊(yùn)藏著豐富的生物資源，而海洋生物體內(nèi)多糖和蛋白含量較高，以及部分海洋生物極易死亡腐敗從而引起DNA的降解，給高純度、完整的基因組DNA的獲取帶來(lái)了極大的困難。而海洋生物通常與陸生動(dòng)植物相比更為復(fù)雜，組裝拼接的難度更大。本次研究使用Nanopore測(cè)序技術(shù)突破了這些瓶頸，完成了海洋魚(yú)類超高質(zhì)量的基因組組裝！研究中使用104X Nanopore測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組組裝，通過(guò)Canu、WTDBG等多款軟件分別進(jìn)行組裝，選取組裝結(jié)果（主要從基因組大小，contig N50，組裝完整性，組裝準(zhǔn)確性等方面評(píng)估）進(jìn)行后續(xù)研究?jī)?yōu)化。研究者最終使用WTDBG軟件組的基因組版本結(jié)合Hi-C技術(shù)的進(jìn)一步優(yōu)化，組裝完成474.31 Mb基因組，并將99.44%的基因組掛載至20條染色體上，?ContigN50提升至22.46 Mb，且最長(zhǎng)的Contig達(dá)到32.32 Mb！
圖1?基因組組裝流程
眾所周知，Contig N50是衡量基因組組裝質(zhì)量好壞的一個(gè)重要指標(biāo)，一定程度上來(lái)說(shuō)，ContigN50值越高表示組裝的質(zhì)量越好。與已有鲀形目基因組比較，綠鰭?cǎi)R面鲀基因組組裝的ContigN50超過(guò)了同樣使用三代測(cè)序進(jìn)行組裝的黃鰭東方鲀（Takifugu flavidus）的5倍，更是超過(guò)了翻車魚(yú)（Mola mola）的1000倍！
表1?鲀形目基因組比較
而與近年的一些魚(yú)類基因組ContigN50相比，綠鰭?cǎi)R面鲀基因組組裝的連續(xù)性同樣也是表現(xiàn)超群。從表2中不難發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)魚(yú)類基因組ContigN50水平基本在Kb與Mb之間徘徊，而本次使用Nanopore組裝的綠鰭?cǎi)R面鲀直接上升了一個(gè)數(shù)量級(jí)，完成了連續(xù)性超強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)基因組。
表2 近年已發(fā)表的魚(yú)類基因組
優(yōu)秀的基因組不能只看連續(xù)性，完整性也同樣重要。研究者分別用Racon及Pilon進(jìn)行兩輪及三輪糾錯(cuò)來(lái)對(duì)WTDBG的組裝的基因組進(jìn)行polish，并對(duì)糾錯(cuò)前后基因組的完整性進(jìn)行了多個(gè)方面的評(píng)估。
利用bwa軟件將二代數(shù)據(jù)與參考基因組進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，二代reads雙端比對(duì)效率為97.41%，表明三代組裝基因組完整性較好。
CEGMA v2.5數(shù)據(jù)庫(kù)包含了真核生物458個(gè)保守的核心基因。使用CEGMA v2.5來(lái)評(píng)估最終基因組組裝的完整性。在最終版的基因組中，通過(guò)序列相似性（Identity > 70%）比對(duì)，共找到了458個(gè)核心基因中的442個(gè)（96.51%）。而在CEGMA v2.5所包含的更加保守的248個(gè)序列中，91.13%可以在組裝的基因組找到。
BUSCO v2中actinopterygii數(shù)據(jù)庫(kù)包含了真核生物中的4584個(gè)保守的核心基因。我們使用BUSCO v2.0軟件來(lái)評(píng)估基因組組裝的完整性。在我們組裝的基因中，共找到4,324個(gè)完整的BUSCO基因，其中單拷貝的4,213個(gè)，多拷貝的有111個(gè)；不完整的BUSCO基因有62個(gè)；未找到的有198個(gè)，BUSCO評(píng)估基因組完整度為94.33%（Complete BUSCOs/Total BUSCOs）。
評(píng)估結(jié)果均顯示完整度在94%以上，說(shuō)明了基因組的整體組裝質(zhì)量非常優(yōu)異，將對(duì)后續(xù)的下游分析極為有利，具有無(wú)限的開(kāi)發(fā)潛力。
總結(jié)
本次案例中的海洋經(jīng)濟(jì)魚(yú)——綠鰭?cǎi)R面鲀通過(guò)Nanopore平臺(tái)進(jìn)行了超長(zhǎng)讀長(zhǎng)的基因組測(cè)序，使海洋生物組裝指標(biāo)（contig N50）超越22 Mb！成為了目前為止我們所知的海洋魚(yú)類N50最高的基因組！同時(shí)評(píng)估結(jié)果也表明，組裝的準(zhǔn)確度與完整性也非常高。
百邁客ONT平臺(tái)超強(qiáng)連續(xù)性基因組研究展示(部分)
結(jié)合往期以及如上表給大家展示的組裝數(shù)據(jù)不難看出，在一定組裝深度的情況下，Nanopore技術(shù)能帶來(lái)高水平的基因組，甚至還會(huì)出現(xiàn)新的驚喜！無(wú)論是動(dòng)物植物還是微生物、無(wú)論是基因組轉(zhuǎn)錄組還是宏基因、無(wú)論是舊數(shù)據(jù)的更新還是高難度物種的破譯，Nanopore都能出彩表現(xiàn)~
截至目前，百邁客Nanopore平臺(tái)已經(jīng)完成了近400種物種的DNA建庫(kù)測(cè)序工作，擁有大量的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)！無(wú)論是技術(shù)還是項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)上，我們都實(shí)力過(guò)硬！期待越來(lái)越多可喜的結(jié)果交付到各位老師的手中~
Nanopore 官方認(rèn)證證書(shū)
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