DNA測(cè)序技術(shù)在過(guò)去的40年中，經(jīng)歷了巨大的改進(jìn)與變化。早在1977年，首次報(bào)道了Sanger和Maxam–Gilbert測(cè)序方法，Sanger測(cè)序的最大序列長(zhǎng)度約1 kb。其對(duì)DNA總量的要求較高，一般通過(guò)克隆靶標(biāo)DNA序列并連接載體，進(jìn)而通過(guò)原核細(xì)胞大腸桿菌(E. coli)擴(kuò)增（當(dāng)時(shí)基因組De novo采用BAC文庫(kù)測(cè)序方式），其讀長(zhǎng)短且耗時(shí)；NGS（Next-Generation Sequencing )二代測(cè)序包含很多技術(shù)平臺(tái)，其特征是對(duì)大量的DNA分子并行測(cè)序，多年來(lái)已有4個(gè)主要的NGS平臺(tái)投入商業(yè)使用：羅氏454平臺(tái), Illumina GA/Solexa 平臺(tái), ABI SOLiD平臺(tái)和Life Torrent平臺(tái)。在過(guò)去的10年中，Illumina因其低成本，高速和高產(chǎn)而成為測(cè)序市場(chǎng)的主要供應(yīng)商，Illumina測(cè)序平臺(tái)具有廣適性，因此NGS已廣泛用于探索基因組學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，包括腫瘤學(xué)，微生物學(xué)，環(huán)境基因組學(xué)，宏基因組學(xué)及醫(yī)學(xué)，環(huán)境和農(nóng)業(yè)研究等，隨時(shí)其廣泛的應(yīng)用，其劣勢(shì)也逐漸的突顯，即：二代測(cè)序（Illumina為代表）讀長(zhǎng)短仍然是生物學(xué)研究的重要瓶頸，這限制了許多生物學(xué)研究的準(zhǔn)確性，尤其是在基因組組裝研究中。在片段重復(fù)（segmental duplication），結(jié)構(gòu)變異（SV，structural variations）或旁系同源區(qū)段分析中使用短讀長(zhǎng)測(cè)序可能會(huì)導(dǎo)致大量假陽(yáng)性。盡管測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析在進(jìn)步，但大型基因組的從頭組裝仍然具有挑戰(zhàn)性。自2015年起，以PacBio和Nanopore為代表的長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)開始在動(dòng)植物基因組De novo中初露鋒芒（圖1 A和B）。
圖1 不同測(cè)序技術(shù)讀長(zhǎng)，準(zhǔn)確性及基因組連續(xù)性評(píng)估
一、三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)單分子測(cè)序技術(shù)的發(fā)展
?長(zhǎng)讀長(zhǎng)單分子測(cè)序技術(shù)（Long read single-molecule sequencing technology）又稱第三代測(cè)序技術(shù)TGS（Third-Generation Sequencing），早在2004年，由美國(guó)太平洋生物科學(xué)公司Pacific Biosciences (PacBio)?創(chuàng)立的實(shí)時(shí)（SMRT）測(cè)序是較早被廣泛使用的長(zhǎng)讀測(cè)序技術(shù)，SMRT測(cè)序產(chǎn)生的Reads可達(dá)到約200 kb。其提供了技術(shù)上的優(yōu)勢(shì)，以鑒定遺傳變異并進(jìn)一步研究其基因功能，同時(shí)作為動(dòng)植物基因組組裝日臻進(jìn)步完善的主要驅(qū)動(dòng)力，自2015年，首篇純PacBio三代數(shù)據(jù)組裝復(fù)活草（Nature. 2015）基因組見刊Nature，開啟了三代動(dòng)植物基因組De novo的紀(jì)元。與Sanger測(cè)序和NGS測(cè)序類似，PacBio測(cè)序同樣采用邊合成邊測(cè)序的方式，以其中一條DNA鏈為模板，通過(guò)DNA聚合酶合成另外一條鏈（圖2 A和B）。PacBio測(cè)序平臺(tái)相繼推出RS II，Sequel和Sequel II平臺(tái)并投入使用（Table 1）。2005年，英國(guó)牛津納米孔技術(shù)公司
圖2 三代PacBio測(cè)序原理
圖3 三代Nanopore測(cè)序原理
二、三代長(zhǎng)讀長(zhǎng)單分子測(cè)序技術(shù)PacBio和Nanopore的比較
PacBio和Nanopore具有共同的優(yōu)點(diǎn)，即長(zhǎng)讀長(zhǎng)；同時(shí)也具有共同的缺點(diǎn)即高錯(cuò)誤率（糾錯(cuò)前隨機(jī)分布的?5–20％堿基錯(cuò)誤率），隨著新測(cè)序儀和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，測(cè)序平臺(tái)的優(yōu)缺點(diǎn)有望發(fā)生改變，無(wú)論是PacBio還是ONT測(cè)序平臺(tái)都致力于獲得更長(zhǎng)讀長(zhǎng)的reads的同時(shí)，兼獲高準(zhǔn)確的堿基序列信息。
圖4 PacBio與Nanopore測(cè)序原理及信號(hào)識(shí)別原理比較
圖5 PacBio CCS測(cè)序原理及準(zhǔn)確性評(píng)估
Nanopore超長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序：盡管組裝方法不斷在改進(jìn)，且已開發(fā)物理圖譜技術(shù)（光學(xué)圖譜），但讀長(zhǎng)長(zhǎng)短仍然是高質(zhì)量動(dòng)植物基因組的限制因素。如植物基因組由于高雜合，及其復(fù)雜的多倍性和高重復(fù)含量，其組裝仍然具有挑戰(zhàn)性，讀長(zhǎng)必須超過(guò)基因組中的主要重復(fù)序列長(zhǎng)度，及嵌合的長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）或單倍型Blocks，其長(zhǎng)度可能跨越20–200 kb。雖然PacBio是提供Long Reads（>1 kb）的技術(shù)，且通常 Reads N50長(zhǎng)度可大于20 kb，但即便是幾乎完美的15 kb reads可能無(wú)法組裝復(fù)雜植物基因組中經(jīng)常出現(xiàn)的嵌合及高度相似的重復(fù)序列。而ONT測(cè)序平臺(tái)大大解決了這一問題，與PacBio reads平均長(zhǎng)度項(xiàng)目（圖6），一小部分ONT reads讀長(zhǎng)超過(guò)300 kb，同時(shí)PacBio不包含任何大于150 kb的reads。許多復(fù)雜的植物基因組具有大于20 kb或更長(zhǎng)的重復(fù)序列，所以即便目前ONT具有一定錯(cuò)誤率，但其大大促進(jìn)了基因組的組裝，從而顯著提高了基因組連續(xù)性或完整性。例如：使用ONT測(cè)序更新的擬南芥Col-0基因組最終通過(guò)組裝，減少到40個(gè)Contigs，且跨越了染色體臂（端粒到著絲粒），同時(shí)解決了前期在TAIR10參考基因組中存在的gaps及組裝錯(cuò)誤(Jupe et al. 2020)。
圖6 三代Nanopore和PacBio測(cè)序讀長(zhǎng)比較
三、百邁客雙平臺(tái)(Nanopore+PacBio）動(dòng)植物基因組De novo研究策略—魚和熊掌可兼得
“魚，我所欲也，熊掌亦我所欲也；二者不可得兼，舍魚而取熊掌者也。正如在動(dòng)植物基因組研究中，針對(duì)基因組組裝，為了兼顧長(zhǎng)讀長(zhǎng)的同時(shí)，獲得高準(zhǔn)確性的物種基因組密碼信息，在選擇測(cè)序技術(shù)選擇(PacBio or Nanopore?)上總會(huì)有魚和熊掌不可兼得的感覺。長(zhǎng)久以來(lái)，百邁客一直致力于成為“專業(yè)的基因組組裝專家”，擁有雙平臺(tái)的基礎(chǔ)上（2015年首次引進(jìn)PacBio平臺(tái)；2017年首次引進(jìn)Nanopore平臺(tái)），力求整合雙平臺(tái)各自的優(yōu)勢(shì)，著力于開發(fā)各種軟件、算法，為每個(gè)物種提供訂制的“基因組套餐”，即打造高質(zhì)量，高完整性的物種基因組。從本章節(jié)起，小編后續(xù)會(huì)結(jié)合新的技術(shù)策略、測(cè)試數(shù)據(jù)及文章案例，為大家?guī)?lái)全新的基因組研究策略，旨在獲得高度連續(xù)性基因組的前提下，同時(shí)完成高準(zhǔn)確性動(dòng)植物基因組密碼的破譯，即魚與熊掌可兼得。
首先通過(guò)百邁客三代Nanopore和PacBio平臺(tái)相關(guān)物種測(cè)序讀長(zhǎng)（表1）及組裝結(jié)果的比較（表2），進(jìn)一步通過(guò)我們的實(shí)際案例來(lái)看一下Nanopore測(cè)序平臺(tái)在基因組組裝中的優(yōu)勢(shì)。
通過(guò)雙平臺(tái)實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)的比較分析: Nanopore平臺(tái)平均讀長(zhǎng)為28.5 Kb左右，Reads N50平均讀長(zhǎng) 38Kb左右；PacBio CLR平均讀長(zhǎng)20 Kb左右，Reads N50平均讀長(zhǎng) 28Kb左右；CCS平均讀長(zhǎng)12-15 Kb，Reads N50 16~18Kb，發(fā)現(xiàn)Nanopore比PacBio平臺(tái)讀長(zhǎng)高10 Kb左右，而PacBio CCS模式讀長(zhǎng)遠(yuǎn)低于CLR模式。
同時(shí)通過(guò)PacBio和Nanopore雙平臺(tái)測(cè)序數(shù)據(jù)組裝結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn)，利用PacBio數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組組裝Contig N50一般達(dá)到Mb級(jí)別，而利用Nanopore數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組組裝，Contig N50指標(biāo)平均水平基本能再提升2倍或者更高，甚至許多物種能達(dá)到幾十Mb（如百邁客利用Nanopore測(cè)序平臺(tái)組裝的水產(chǎn)動(dòng)物綠鰭?cǎi)R面鲀基因組，Contig N50高達(dá)22 Mb）。
由于Nanopore測(cè)序Reads讀長(zhǎng)長(zhǎng)，PacBio Sequel II HiFi模式測(cè)序準(zhǔn)確性高達(dá)99%以上，為了同時(shí)利用其雙平臺(tái)各自的優(yōu)勢(shì)，我們擬通過(guò)Nanopore測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)某多倍體植物進(jìn)行基因組組裝，同時(shí)通過(guò)低深度PacBio CCS數(shù)據(jù)進(jìn)行Polish，進(jìn)而對(duì)該多倍體植物基因組連續(xù)性，完整性及準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估，以獲得高連續(xù)性，高準(zhǔn)確的基因組密碼信息，測(cè)試結(jié)果如下：
4.?不同深度CCS 數(shù)據(jù)Polish后二代數(shù)據(jù)回比結(jié)果
5.?通過(guò)將20?x?CCS數(shù)據(jù)分別回比到10 x PacBio CCS polish及100 x Nanopore+50 x Illumina Polish后基因組，截取基因組上特性區(qū)域，進(jìn)行組裝基因組單堿基準(zhǔn)確性的比對(duì)與評(píng)估，發(fā)現(xiàn)10?x?PacBio CCS polish后的結(jié)果提升效果明顯，我們挑選了幾個(gè)實(shí)例如下：
區(qū)域1：
PacBio CCS回比結(jié)果（10x CCS Polish基因組）
PacBio CCS回比結(jié)果（100 x ONT+50 x Illumina Polish基因組）
區(qū)域2：
PacBio CCS回比結(jié)果（10x CCS Polish基因組）
PacBio CCS回比結(jié)果（100x Nanopore+50x Illumina Polish基因組）
上述分析結(jié)果中，進(jìn)一步證實(shí)了前期的推測(cè)，利用Nanopore超長(zhǎng)讀長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，組裝獲得高連續(xù)性基因組（Contig N50 約10 Mb），同時(shí)結(jié)合PacBio CCS高準(zhǔn)確性測(cè)序，進(jìn)一步提升基因組中單堿基的準(zhǔn)確度，即魚和熊掌可兼得。高連續(xù)性基因組的獲得，對(duì)后續(xù)功能基因定位，結(jié)構(gòu)變異檢測(cè)具有重要的意義；同時(shí)高準(zhǔn)確的基因組的獲得，對(duì)于超大基因組，多倍體基因組等復(fù)雜基因組的LTR的熱點(diǎn)區(qū)域的研究更具突破性的意義。除此之外。在很多動(dòng)植物基因組上的確存在高度復(fù)雜的區(qū)域，即使通過(guò)高深度PacBio?CCS數(shù)據(jù)依然無(wú)法矯正，這就需要通過(guò)其它相應(yīng)的技術(shù)及軟件參數(shù)整合來(lái)提升基因組的準(zhǔn)確性。
四、雙平臺(tái)(Nanopore+PacBio）基因組De novo高分文章賞析
在對(duì)同源四倍體紫花苜蓿（Medicago sativa?L.）基因研究中，首先利用了70 GB，~22x PacBio CCS數(shù)據(jù)進(jìn)行基因組組裝，組裝獲得紫花苜?；蚪M大小3154 Mb，Contig N50=459 kb, 然后利用ALLHiC進(jìn)行同源染色體組群的劃分，最后通過(guò)Hi-C互作熱圖、遺傳圖譜共線性、ONT數(shù)據(jù)回比、BUSCO完整性、轉(zhuǎn)錄組對(duì)基因組完整性等進(jìn)行評(píng)估，值得注意的是在ONT數(shù)據(jù)回比評(píng)估中（Table 3)，文中篩選了99 GB ONT long reads中的最長(zhǎng)200條reads（ranged from 95 to 263 Kb）進(jìn)行回比，發(fā)現(xiàn)89%的的reads都能比對(duì)到single染色體上，結(jié)合其它評(píng)估方法，進(jìn)一步說(shuō)明了組裝及染色體位置的準(zhǔn)確性。
在小墊柳（Cushion willow）基因組組裝中，首先利用SMARTdenovo對(duì)糾錯(cuò)后的74xONT數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，然后分別利用125xPacBio數(shù)據(jù)(two rounds )與Illumina數(shù)據(jù)(five rounds )進(jìn)行polish，基因組完整性評(píng)估后，利用Hi-C將Contig掛載到染色體水平，最終組裝獲得小墊柳基因組大小339.588 Mb，Contig N50=9.522 Mb。?(Table 4)
五、百邁客Nanopore、PacBio平臺(tái)動(dòng)植物基因組合作文章總覽(部分）
北京百邁客生物科技有限公司自2015年引入Pacbio測(cè)序平臺(tái)，2017年初引入Nanopore測(cè)序平臺(tái)以來(lái)，截止到目前百邁客已擁PacBio平臺(tái)：RS Ⅱ、PacBio Sequel、PacBio sequel Ⅱ；Nanopore 平臺(tái)：PromethION-48、PromethION-β、Nanopore GridION、MinION，擁有主流三代測(cè)序儀，尤其針對(duì)復(fù)雜超大基因組測(cè)序，百邁客生物具有三代測(cè)序通量，以滿足超大基因組的組裝需求。同時(shí)PacBio和Nanopore兩大主流三代測(cè)序平臺(tái)各自及組合經(jīng)驗(yàn)，為老師們提供了可參考且全面優(yōu)質(zhì)的選擇！選擇我們，提供專屬于您基因組套餐！
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