轉(zhuǎn)錄組多組學(xué)解析揭示Tfr1基因?qū)γ咨窘M織的產(chǎn)熱能力以及分化的影響

6月新鮮出爐的公司合作文章中浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究者借助轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，探究了Tfr1基因?qū)ψ厣?米色脂肪組織產(chǎn)熱能力和組織分化方面的功能，為肥胖與代謝疾病的治療策略提供了新方向。

研究背景

人體內(nèi)存在著白色脂肪組織（white adipose tis sue，WAT）、棕 色 脂 肪 組 織（brown adipose tissue， BAT）和米色脂肪組織。WAT具有儲能的作用，過量積聚可導(dǎo)致肥胖；棕色脂肪為產(chǎn)熱脂肪。米色脂肪是白色脂肪組織在寒冷、運(yùn)動(dòng)、藥物等作用下發(fā)生“棕色化”形成。米色脂肪具有不同于白色脂肪和棕色脂肪的形態(tài)和功能，具有增加機(jī)體產(chǎn)熱、促進(jìn)能量消耗，抑制肥胖形成的發(fā)等作用。因此近幾年來促進(jìn)米色脂肪生成成為肥胖癥等代謝疾病治療的研究熱點(diǎn)。

技術(shù)平臺

RNA-seq、Chip-seq、蛋白組

研究材料及思路

研究結(jié)果

 

1. 多組學(xué)鎖定研究目標(biāo)-Tfr1基因

Fig 1 在CL-316，243處理的小鼠中Tfr1基因?qū)﹁F穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用

本研究首先利用Chip-seq （Fig 1A/B）、RNA-seq（Fig 1D/E）、蛋白組三種技術(shù)手段，從轉(zhuǎn)錄調(diào)控、mRNA、蛋白質(zhì)三個(gè)不同層面發(fā)現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)組（C57BL/6J mice）中與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的啟動(dòng)子 、基因、蛋白均有明顯的富集。為了驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，對與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的啟動(dòng)子進(jìn)行用Chip-qPCR（Fig 1C）的方法驗(yàn)證，對鐵轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白做了WB驗(yàn)證（Fig 1G），結(jié)果都顯示Tfr1基因在實(shí)驗(yàn)組（C57BL/6J mice）中的表達(dá)量明顯增加。綜上所述，Tfr1基因在CL-316，243處理的小鼠中Tfr1基因?qū)﹁F穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用。

2. Tfr1基因在米色脂肪組織和棕色脂肪組織的形成和產(chǎn)熱能力方面有重要作用

Fig2 Tfr1基因缺失可減少冷誘導(dǎo)的脂肪組織產(chǎn)熱

為了探究Tfr1基因在脂肪細(xì)胞的中有哪些作用，本研究構(gòu)建了Tfr1 敲除小鼠（Tfr1Adp/Adp ）和Tfr1 野生小鼠（ Tfr1fl/fl ）。對Tfr1Adp/Adp和Tfr1fl/fl的表型生理生化的指標(biāo)、mRNA、蛋白水平進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)相對于對照組來說Tfr1Adp/Adp 小鼠雖然在整體體重上沒有改變，但是其白色脂肪組織和棕色脂肪組織的重量明顯降低（Fig2 A/B）。經(jīng)過冷處理后對照組能很快維持溫度恒定（Fig2 C），形成更小的小脂滴（多房脂質(zhì)），但是實(shí)驗(yàn)組維持溫度的能力明顯降低，也不能形成更小的小脂滴（多房脂質(zhì)）。在mRNA水平和蛋白水平，冷處理的實(shí)驗(yàn)組中產(chǎn)熱相關(guān)基因、脂肪分解相關(guān)蛋白改變的程度都沒有對照組中明顯。這些現(xiàn)象表明Tfr1基因在棕色/米色脂肪細(xì)胞的發(fā)育和產(chǎn)熱能力維持的過程中有著重要的作用。

3. Tfr1基因在米色脂肪組織的產(chǎn)熱方面的機(jī)制

Fig3 Tfr1基因?qū)ρ€(wěn)定、胰島素敏感性、局部炎癥的影響

為了進(jìn)一步探究Tfr1基因在棕色/米色脂肪細(xì)胞的發(fā)育和產(chǎn)熱能力維持的過程的作用機(jī)制。分別對Tfr1Adp/Adp和Tfr1fl/fl 進(jìn)行高脂肪、正常喂養(yǎng)，并對4組樣本分別進(jìn)行葡萄糖耐量、胰島素抵抗、呼吸速率、能量消耗、CD11b+F4/80巨噬細(xì)胞、CD11c+巨噬細(xì)胞的比例等實(shí)驗(yàn)。數(shù)據(jù)表明在高脂肪處理實(shí)驗(yàn)組 中，整體體重（Fig3 A）、白色脂肪組織（Fig3 B）大小都沒有明顯的差異。然而在高脂實(shí)驗(yàn)組中棕色脂肪組織完全轉(zhuǎn)化為白色脂肪組織（Fig3 B）。同時(shí)小鼠空腹血糖、血脂、非酯化脂肪酸脂肪酸的含量明顯高于高脂對照組。高脂喂養(yǎng)后，盡管血液中血糖含量沒有太大的變化，但是驗(yàn)組中葡萄糖耐量、胰島素抵抗的值都要高于高脂對照組（Fig3E/F）。這說明高脂實(shí)驗(yàn)組中糖耐受性受損可能是導(dǎo)致空腹血糖升高的原因。而呼吸速率、能量消耗的實(shí)驗(yàn)表明缺失Tfr1基因后呼吸速率會增加，能量消耗能力降低（Fig3G/H）。在正常喂養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組中白色脂肪組織相對于正常對照組來說明顯減少。 上述數(shù)據(jù)表明，能量消耗降低并沒有導(dǎo)致高脂喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組小鼠體重增加，可能是由于Tfr1缺失對白色脂肪細(xì)胞的內(nèi)在的影響。
通過免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在高脂喂養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組中巨噬細(xì)胞的數(shù)量在白色脂肪組織和棕色脂肪組織中都有增加，棕色脂肪組織中CD11c+ 巨噬細(xì)胞的數(shù)量要高于高脂對照組（Fig3J/K），同時(shí)棕色組織中也產(chǎn)熱相關(guān)的基因也發(fā)生較大的變化。透射電鏡的結(jié)果顯示高脂喂養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組中線粒體會更小，顏色更深。這些結(jié)果均表明Tfr1 基因在脂肪細(xì)胞能量消耗扮演很重要的角色。
為了進(jìn)一步挖掘Tfr1 基因作用的機(jī)制，對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)再次進(jìn)行挖掘。在基因富集分析(GSEA)中發(fā)現(xiàn)與低氧相關(guān)的基因具有明顯的差異， Hif1α基因與同家族的其他基因在表達(dá)趨勢以及表達(dá)量上都有明顯的差異。在冷處理后，Hif1α蛋白和Tfr1蛋白的表達(dá)量都有上升。通過免疫熒光的結(jié)果顯示Hif1α位于細(xì)胞核內(nèi)。構(gòu)建了Hif1α基因敲除小鼠，并對冷處理下Hif1α基因表達(dá)量、蛋白水平、組織形態(tài)等結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Hif1α基因并非米色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱必要的基因。HIF1α ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Hif1α基因是通過調(diào)控Tfr1 基因的啟動(dòng)子區(qū)域間接參與米色脂肪細(xì)胞產(chǎn)熱過程。

4. 在脂肪細(xì)胞中Tfr1基因缺失會促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)換為肌肉細(xì)胞

對Tfr1Adp/Adp和Tfr1fl/fl 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)在基因敲除小鼠中，棕色脂肪組織標(biāo)志性的基因明顯下降，白色脂肪組織標(biāo)志性基因明顯上升。但Lep基因卻例外，只有在冷處理后的實(shí)驗(yàn)組中，表達(dá)量上升。基因富集分析表明，有部分肌肉細(xì)胞的標(biāo)志性基因、干細(xì)胞標(biāo)志性基因、及肌源性標(biāo)志性基因均有上調(diào)，而與氧化磷酸化、脂肪生成和脂肪酸代謝相關(guān)的基因卻明顯下調(diào)。免疫共沉淀的結(jié)果也顯示脂肪相關(guān)的蛋白含量降低，而肌纖維標(biāo)志蛋白含量明顯增加。上述結(jié)果表明，在脂肪細(xì)胞中Tfr1基因缺失會促進(jìn)棕色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)換為肌肉細(xì)胞。

5. 總結(jié)

運(yùn)用多組學(xué)的技術(shù)綜合研究發(fā)現(xiàn)Tfr1為米色脂肪細(xì)胞生熱調(diào)控重要的候選基因。研究表明當(dāng)小鼠米色脂肪細(xì)胞缺乏Tfr1會破壞產(chǎn)熱，胰島素抗性增加、同時(shí)伴有鐵缺乏性慢性炎癥和線粒體功能障礙。米色脂肪細(xì)胞冷處理可以維持HIF1a的穩(wěn)定，激活Tfr1基因，Hif1α基因可以減少產(chǎn)熱基因的表達(dá)，卻不改變米脂細(xì)胞體內(nèi)核心的溫度。值得注意的是，Tfr1在肩胛間棕色脂組織(iBAT)缺失會導(dǎo)致棕色前體脂肪細(xì)轉(zhuǎn)換為向白色脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞。相反，在tfr1缺失個(gè)體中，如飲食中長期缺乏鐵則不能轉(zhuǎn)化出現(xiàn)上述的轉(zhuǎn)化。此外，如果Tmprss6缺失也會小鼠腹股溝白色脂肪組織和肩胛間棕色脂組織兩個(gè)部位鐵缺乏。同時(shí)會激發(fā)低溫誘導(dǎo)型米色脂肪細(xì)胞形成和棕色脂肪產(chǎn)熱。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明不管是在依賴鐵離子或是不依賴鐵離子的產(chǎn)熱過程中Tfr1都起著重要的作用。