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 分類： 醫(yī)學(xué)研究

各位有做空間轉(zhuǎn)錄組想法的伙伴們，還在為買不到易燃易爆的異戊烷犯難嗎？還在為異戊烷純度不夠煩惱嗎？還在為解決不了異戊烷的問題實(shí)驗(yàn)停滯不前嗎？今天，百邁客跟大家分享幾種空間轉(zhuǎn)錄組組織包埋的方法，沒有異戊烷也可以冷凍組織喲~

 

組織不應(yīng)直接置于液氮中，因?yàn)闇囟炔羁赡軙?huì)導(dǎo)致組織表面沸騰，從而導(dǎo)致氣穴和不均勻的冷凍這可能會(huì)破裂并在形態(tài)上破壞組織。如果您有異戊烷且純度足夠高的話，還是推薦您用異戊烷進(jìn)行組織冷凍的，具體方法如下：

a.用異戊烷（足以完全浸沒組織）填充三分之二的金屬燒杯，然后放入液氮杜瓦瓶中（與異戊烷相同的高度）以充分接觸，孵育 15 分鐘。

b.將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表明干燥。

c.標(biāo)記冷凍模具以標(biāo)記組織的方向，用預(yù)冷的 OCT 填充模具，避免產(chǎn)生氣泡。

d.用鑷子將組織放入含預(yù)冷OCT的模具中，用OCT 覆蓋任何裸露組織的表面，確認(rèn)沒有氣泡，尤其是在組織附近。

e.用鑷子將模具放到異戊烷中，但不要使異戊烷浸入模具內(nèi)，直到組織凍結(jié)。冷凍時(shí)間可根據(jù)組織類型和大小而變化。

f.冷凍后，將組織轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的冷凍管中，然后放在干冰上。

g.將 OCT 包埋的組織塊保存在–80℃的密封容器中，以便長期保存，或立即進(jìn)行冷凍切片

 

如果您的新鮮樣本打算直接進(jìn)行空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)，且實(shí)驗(yàn)室沒有異戊烷的話百邁客在這里給您推薦直接用干冰粉進(jìn)行組織冷凍包埋，具體方法如下：

a.直接準(zhǔn)備干冰粉或用研缽將干冰塊研磨成粉

b.將新鮮組織置于培養(yǎng)皿中，用干凈的紗布或者紙巾吸干組織周圍血水，盡量使組織表明干燥。

c.標(biāo)記冷凍模具以標(biāo)記組織的方向，用預(yù)冷的 OCT 填充模具，避免產(chǎn)生氣泡

d.用鑷子將組織放入含預(yù)冷OCT的模具中，用OCT 覆蓋任何裸露組織的表面，確認(rèn)沒有氣泡，尤其是在組織附近。

e.將組織放入干冰粉中，直到組織凍結(jié)。此方法冷凍包埋組織較慢，且須在干冰粉上靜置一段時(shí)間，確保組織冷凍均勻，約需30分鐘。

f.冷凍后，將組織轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的冷凍管中，然后放在干冰上。

g.將 OCT 包埋的組織塊保存在–80℃的密封容器中，以便長期保存，或立即進(jìn)行冷凍切片。

 

組織冷凍包埋組織的方法就給大家介紹到這里，下面跟大家分享一篇結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)探討小膠質(zhì)細(xì)胞與腦外傷關(guān)系的文章。

 

空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)輔助揭示再生小膠質(zhì)細(xì)胞

依賴白介素-6促進(jìn)大腦修復(fù)的機(jī)制

英文題目：Repopulating Microglia Promote Brain Repair in an?IL-6-Dependent Manner

中文題目：再生小膠質(zhì)細(xì)胞依賴白介素-6促進(jìn)大腦修復(fù)

發(fā)表雜志：cell

影響因子：38.637

 

研究方法

材料：小鼠大腦

方法：通過藥理學(xué)或遺傳方法誘導(dǎo)小鼠大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞的更替，結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)闡述小膠質(zhì)細(xì)胞具有促進(jìn)修復(fù)和減輕腦損傷引起的認(rèn)知缺陷的功能。

 

研究背景

小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中最豐富的免疫細(xì)胞，在大腦發(fā)育、維持和疾病中發(fā)揮重要作用。這類細(xì)胞雖與外周巨噬細(xì)胞親緣性不高，但在發(fā)育早期就存在于大腦中，并通過促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的形成、突觸連接和凋亡細(xì)胞的去除，來促進(jìn)神經(jīng)回路的塑造。小膠質(zhì)細(xì)胞被認(rèn)為在成年大腦中起著類似的生理作用，它們還能對影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性疾病和急性損傷做出強(qiáng)烈反應(yīng)，由于小膠質(zhì)細(xì)胞與單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞有許多共同的表型特征，因此闡明它們對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病的作用具有重要意義。然而，小膠質(zhì)細(xì)胞不僅被報(bào)道在健康成年大腦中介導(dǎo)學(xué)習(xí)相關(guān)的突觸可塑性，而且還在神經(jīng)炎癥和正常老化過程中的病理和認(rèn)知功能障礙等方面起著關(guān)鍵作用。

具有廣泛小膠質(zhì)細(xì)胞活化的慢性非溶解性炎癥是外傷性腦損傷的一個(gè)重要特征，本文利用這一特性直接探索小膠質(zhì)細(xì)胞在影響神經(jīng)退行性變和認(rèn)知功能方面的假定作用。在急性期，已知小膠質(zhì)細(xì)胞對腦損傷釋放的損傷相關(guān)分子模式作出快速反應(yīng)，然后以ATP依賴的方式向損傷部位遷移,清除細(xì)胞碎片被認(rèn)為是早期小膠質(zhì)細(xì)胞活化的有利方面，這是傷口愈合過程的關(guān)鍵部分。另一方面，在炎癥基因表達(dá)和/或吞噬現(xiàn)象出現(xiàn)時(shí)，許多腦小膠質(zhì)細(xì)胞在創(chuàng)傷性腦損傷的慢性階段仍保留激活狀態(tài)，盡管直接證據(jù)不足，這種持續(xù)的激活狀態(tài)通常被認(rèn)為是有害的。

總的來說，關(guān)于小膠質(zhì)細(xì)胞與腦外傷的關(guān)系，仍有很大的不確定性。作為繼發(fā)性炎癥病理的驅(qū)動(dòng)因素，它們是否確實(shí)惡化了神經(jīng)系統(tǒng)的預(yù)后?它們是否妨礙或支持內(nèi)源性修復(fù)過程，或者可能在損傷過程的不同時(shí)間階段都存在所有類型的過程?本文將通過一個(gè)外傷性腦損傷小鼠模型給出以上問題的答案。

 

研究結(jié)果

1.?外傷性腦損傷后，消除小膠質(zhì)細(xì)胞并不能提高認(rèn)知能力，也不能刺激神經(jīng)形成
首先通過喂食小鼠集落刺激因子-1受體（CSF-1R）拮抗劑PLX5622 ，使小膠質(zhì)細(xì)胞衰竭，來檢查外傷性腦損傷（TBI）后小膠質(zhì)細(xì)胞缺失是否會(huì)改變海馬依賴任務(wù)中的認(rèn)知結(jié)果。用可控皮質(zhì)撞擊造成TBI,在腦外傷前3周開始持續(xù)給藥PLX5622，可導(dǎo)致大范圍的Iba1pos?、TMEM119pos細(xì)胞的丟失，包括海馬區(qū)。在腦外傷后的整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，海馬區(qū)保持95%的功能缺失。這些結(jié)果與喂食食物的小鼠對照組形成鮮明對比。在腦外傷后的12天內(nèi)，海馬內(nèi)的Iba1pos細(xì)胞數(shù)量是假手術(shù)組的5倍。
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圖1A.?腦外傷后Iba1pos小膠質(zhì)細(xì)胞的定量研究圖

圖1B.plx5622處理小鼠術(shù)后12天海馬內(nèi)Iba1pos和TMEM119pos小膠質(zhì)細(xì)胞(綠色)的丟失

 

 

在證實(shí)持續(xù)使用PLX5622治療可有效清除腦小膠質(zhì)細(xì)胞后，接下來測試了三種依賴海馬功能的行為模式下實(shí)驗(yàn)小鼠的認(rèn)知能力，主要測試實(shí)驗(yàn)：活動(dòng)場所回避(APA)，是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的空間學(xué)習(xí)任務(wù)，動(dòng)物被放置在一個(gè)旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)盤上，并要求通過視覺線索不斷改變他們的位置以避免被移動(dòng)到一個(gè)靜止的打擊區(qū)。結(jié)果表明在plx5622處理過的小鼠中并沒有顯著改變運(yùn)動(dòng)行為，而無論是否存在小膠質(zhì)細(xì)胞，假手術(shù)小鼠很快就學(xué)會(huì)了避開打擊區(qū)，因此，在假手術(shù)和非假手術(shù)條件下，小膠質(zhì)細(xì)胞的藥物清除并不影響空間學(xué)習(xí)結(jié)果。在Morris水迷宮和y迷宮任務(wù)中也證實(shí)了這些結(jié)果。

 

2.?創(chuàng)傷性腦損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞的再生減弱了空間學(xué)習(xí)障礙
文章通過兩種獨(dú)立且互補(bǔ)的方法驗(yàn)證了這一點(diǎn)，首先，使用遺傳模型鼠，小膠質(zhì)細(xì)胞可通過白喉毒素(DT)選擇性去除，然后再生（圖2）；其次，使用已建立的藥理學(xué)方法，但用短期而不是持續(xù)的PLX5622治療來誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的更替；對照組小鼠只服用玉米油。結(jié)果表明在創(chuàng)傷性腦損傷急性期誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞再生的遺傳學(xué)和藥理學(xué)方法都顯著改善了活動(dòng)場所回避（APA）的學(xué)習(xí)缺陷

圖2A.遺傳模型鼠在停止注射DT和TBI后 小膠質(zhì)細(xì)胞（紅色）的再生

圖2B . DT與TBI處理后小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目比較灰色線為對照組

3.?創(chuàng)傷性腦損傷后，再生小膠質(zhì)細(xì)胞刺激功能神經(jīng)再生

與同齡假手術(shù)對照組相比，TBI本身可使遺傳模型小鼠的同側(cè)海馬內(nèi)DCXpos細(xì)胞總數(shù)減少＞60%。然而令人驚訝的是，遭受TBI12天后，在遺傳模型鼠小膠質(zhì)細(xì)胞再生過程中未成熟DCXpos神經(jīng)元的總數(shù)增加了~2倍（圖3C），用溴脫氧尿苷（BrdU）進(jìn)行的脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步揭示了損傷后新生神經(jīng)元數(shù)量的大量增加，并在小膠質(zhì)細(xì)胞再生的TBI小鼠中存活至第12天（圖3D），同時(shí)也觀察到了海馬Tbr2pos神經(jīng)元前體的增加和活性，在TBI急性期采用藥理學(xué)方法誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞更新時(shí)，DCXpos細(xì)胞數(shù)量也有類似的增加，在這些條件下也觀察到更多的Tbr2pos神經(jīng)元前體細(xì)胞的存在（圖3E）和活性（圖3F）。為了完全排除外周效應(yīng)和/或脫靶效應(yīng)，直接向模型小鼠海馬中注射DT，僅在局部誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞的再生，再次觀察到TBI后小膠質(zhì)細(xì)胞耗竭和再生刺激神經(jīng)再生。

研究還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)歷過小膠質(zhì)細(xì)胞耗竭和再生的小鼠的大腦海馬組織體積更大（圖3G-I）。

值得注意是，小膠質(zhì)細(xì)胞耗竭和再生對神經(jīng)再生的促進(jìn)作用被限制在一個(gè)狹窄的時(shí)間窗內(nèi)，即損傷后3天內(nèi)，小膠質(zhì)細(xì)胞在此段時(shí)間后的更替并不支持新生神經(jīng)元的產(chǎn)生和生存能力的增強(qiáng)。

圖3C.損傷后12天未成熟 DCXpos神經(jīng)元總數(shù)的定量

圖3D.損傷后12天TBI后新生未成熟 DCXposBrdUpos神經(jīng)元的定量研究

圖3E.損傷后12天中間Tbr2pos神經(jīng)元前體細(xì)胞的定量

圖3F.損傷后12天增殖中間神經(jīng)元祖細(xì)胞(Tbr2posEdUpos)的定量

 

?圖3 .對照組（G）和plx5622處理后（H）12天的小鼠海馬背側(cè)體積

 

4.?小膠質(zhì)細(xì)胞再生的神經(jīng)保護(hù)作用依賴IL-6傳遞信號

在確定了TBI急性期活躍的小膠質(zhì)細(xì)胞再生能刺激功能神經(jīng)發(fā)生后，接下來探索了介導(dǎo)這些效應(yīng)的可能的信號通路。進(jìn)一步探索全海馬組織勻漿中與IL-6信號相關(guān)的基因，發(fā)現(xiàn)IL6Ra、IL-6信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子(IL6st，也稱為gp130 [IL6st/gp130])、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3 (STAT3)的表達(dá)量均隨小膠質(zhì)細(xì)胞的再生而增加，本文首先證實(shí)再生小膠質(zhì)細(xì)胞確實(shí)是增加IL-6表達(dá)的關(guān)鍵因素，然后，確定了存在再生小膠質(zhì)細(xì)胞的條件下，海馬顆粒細(xì)胞是腦外傷后的主要白介素-6來源（圖4）。

 

?圖4 .TBI遺傳模型小鼠中IL-6的細(xì)胞來源及正在進(jìn)行再生的小膠質(zhì)細(xì)胞

 

5.?小膠質(zhì)細(xì)胞的再生具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特征，可以調(diào)節(jié)腦外傷后的微環(huán)境
比較原始和再生小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組時(shí)發(fā)現(xiàn)大量差異表達(dá)的基因，再生的小神經(jīng)膠質(zhì)對編碼在傷口愈合和修復(fù)中有已知作用的蛋白質(zhì)的基因表現(xiàn)出更高表達(dá)量（例如, Emilin2, Fn1, Alcam, andCspg4），獨(dú)創(chuàng)性通路分析(IPA)進(jìn)一步揭示了涉及模式/損傷識(shí)別和干擾素信號的典型通路的活性降低(圖5A)，此外還反映了再生小膠質(zhì)細(xì)胞的增殖狀態(tài)。主要的變化是再生細(xì)胞的反應(yīng)性降低和增殖能力增強(qiáng)，這是受損大腦中再生小膠質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)譜與原小膠質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)譜的本質(zhì)區(qū)別，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了小膠質(zhì)細(xì)胞再生對其局部微環(huán)境的影響，具體來說，與星形膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)毒性和/或神經(jīng)炎癥(A1)表型相關(guān)的基因受到抑制，在蛋白水平上，通過將這些細(xì)胞與A1標(biāo)記物C3聯(lián)合染色而得到證實(shí)（圖5B）。

圖5A.基于差異基因表達(dá)的12個(gè)經(jīng)典通路的分析圖

 

 

?圖5B.星形膠質(zhì)細(xì)胞C3染色(A1標(biāo)記)的平均熒光強(qiáng)度

 

結(jié)論

在受到損傷影響的大腦區(qū)域中，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的存在不一定對結(jié)果和/或認(rèn)知功能障礙有負(fù)面影響，相反，在受損傷后的大腦中，激活的小膠質(zhì)細(xì)胞似乎大多缺乏支持內(nèi)源性修復(fù)過程的能力。然而，在哺乳動(dòng)物的大腦中和再生生物體如蠑螈和斑馬魚，可以誘導(dǎo)出一種可再生的小膠質(zhì)細(xì)胞表型，炎癥信號在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本文已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了IL-6信號通路與這種有益表型相關(guān)的關(guān)鍵作用，未來的研究可以進(jìn)一步確定如何利用小膠質(zhì)細(xì)胞再生的獨(dú)特表型特征進(jìn)行治療。

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