高分轉(zhuǎn)錄組研究思路|2020年百邁客醫(yī)學高分案例集錦-上

今年疫情突發(fā)，不知不覺已經(jīng)和疫情抗戰(zhàn)了大半年，九月倏然而至。北京的夏天真是酷熱，前不久去陰雨綿綿的昆明，竟嗅到清甜的“三秋桂子”，心中不禁驚詫：原是秋到了。

秋天本是豐收的季節(jié)，百邁客醫(yī)學今秋有何收獲呢？嗯，言歸正傳，接下來我們要講一講今年，2020年，百邁客醫(yī)學的文章碩果。我們看一看課題如何設(shè)計，怎么利用測序技術(shù)發(fā)文章。下面整理了部分5分以上的百邁客醫(yī)學合作文章研究思路簡介。

 

案例一：轉(zhuǎn)錄組多組學解析揭示Tfr1基因?qū)γ咨窘M織的產(chǎn)熱能力以及分化的影響

在寒冷刺激下或者β腎上腺素能受體激動劑處理后，WAT白色脂肪組織中會出現(xiàn)散在的棕色樣脂肪細胞，稱為“棕色/米色脂肪”組織Brown/Beige adipose tissue，屬于產(chǎn)熱脂肪。鐵穩(wěn)態(tài)對于維持多種細胞類型的細胞功能至關(guān)重要。但是，鐵是否會影響脂肪細胞的產(chǎn)熱特性目前尚不清楚。

研究思路：本文首先從3個組學：β腎上腺素能受體激動劑CL-316,243處理的米色脂肪細胞活躍啟動子標記H3K9/14Ac Chip-seq 以及生理鹽水對照組同時進行RNA-seq、iTRAQ蛋白組測序，多組學整合分析鑒定調(diào)控米色脂肪細胞發(fā)育的關(guān)鍵候選基因Tfr1。再通過構(gòu)建候選基因敲除小鼠模型，從表型、組織、基因表達（RNA-seq）、蛋白表達到機制，層層遞進，逐步由淺到深解析。最終發(fā)現(xiàn)Tfr1通過鐵依賴性和非鐵依賴性機制在產(chǎn)熱脂肪細胞中起重要作用。

 

 

案例二：成纖維細胞重編程為自組織的感覺神經(jīng)節(jié)類器官和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞

文章題目:Generation of self-organized sensory ganglion organoids and retinal ganglion cells from fibroblasts

雜志&IF:Sci Adv,IF=13.116

合作單位：中山大學中山眼科中心眼科學國家重點實驗室&武漢大學人民醫(yī)院眼科中心

鑒于類器官的優(yōu)勢，在研究發(fā)育機制以及對相關(guān)疾病進行建模和治療方面，作者試圖使用可控制體內(nèi)感覺和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子TF，將小鼠和人成纖維細胞重編程為神經(jīng)節(jié)類器官和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞RGC。SG體感神經(jīng)節(jié)和RGC之間廣泛的分子同源性，區(qū)分這2種類型的神經(jīng)元是一個難題，需要篩選RGC特異性標記，需要篩選誘導成纖維細胞自組織和網(wǎng)絡(luò)化的iSG(induced SG)和iRGC(induced RGCs)的最有效方法。

研究思路：通過對多個SG和RGC 轉(zhuǎn)錄因子TF的篩選，作者確定了三個TF組合ABI是重編程小鼠和人類成纖維細胞為自組織和網(wǎng)絡(luò)化iSG類器官的最有效組合。通過免疫染色、qRT-PCR、全細胞膜片鉗記錄、鈣成像以及混合bulk轉(zhuǎn)錄組和單細胞轉(zhuǎn)錄組scRNA-seq方法，能夠證明iSG類器官具有分子和細胞特征、亞型多樣性、電生理特性和周圍神經(jīng)支配能力和周圍SG的特征模式。此外，使用免疫標記和scRNA-seq分析，鑒定出了真正的RGC特異性分子標記，以證明ABI組合具有從成纖維細胞誘導少量iRGC的額外能力。不同于iSG神經(jīng)元，iRGC保持類似于視網(wǎng)膜中內(nèi)源性RGC的分散分布模式。

 

 

案例三：間充質(zhì)干細胞和各種眼細胞之間通過線粒體的細胞間轉(zhuǎn)運實現(xiàn)生物能crosstalk

文章題目:Bioenergetic Crosstalk between Mesenchymal Stem Cells and various Ocular Cells through the intercellular trafficking of Mitochondria

雜志&IF:Theranostics,IF=8.579

合作單位：溫州醫(yī)學院附屬眼視光醫(yī)院視網(wǎng)膜再生醫(yī)療研究組&首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院北京市眼科研究所

線粒體疾病會優(yōu)先影響人眼中能量需求較高的組織，例如視網(wǎng)膜和角膜內(nèi)皮?；陂g充質(zhì)干細胞（MSC）的治療已被證明對眼部變性有益。但是，除了神經(jīng)保護性旁分泌作用外，MSC對視網(wǎng)膜和角膜組織有益作用的潛在機制在很大程度上尚不清楚。這項研究中試圖探究從MSC到眼細胞間轉(zhuǎn)移的線粒體的命運和相關(guān)特征。

研究思路：將MSC與角膜內(nèi)皮細胞（CEC）、661W細胞（感光細胞系）和ARPE-19細胞（視網(wǎng)膜色素上皮細胞系）共培養(yǎng)。免疫熒光實驗、熒光激活細胞分選和共聚焦顯微鏡成像探究細胞間轉(zhuǎn)移的線粒體的特性和命運。測量受體細胞的耗氧率以研究細胞間線粒體轉(zhuǎn)移的影響。進行轉(zhuǎn)錄組分析以研究具有轉(zhuǎn)移線粒體的受體細胞中代謝基因的表達。結(jié)果：線粒體轉(zhuǎn)運/“捐贈”是MSC與各種眼細胞（包括角膜內(nèi)皮，視網(wǎng)膜色素上皮和感光細胞）之間普遍存在的細胞間機制。此外，轉(zhuǎn)運過程取決于基于F-肌動蛋白隧道納米管。接受MSC線粒體的魚藤酮預處理細胞顯示出增加的有氧能力和線粒體基因的上調(diào)?；铙w成像技術(shù)確定了轉(zhuǎn)移的線粒體的最終命運：通過溶酶體降解或通過胞吐作用形成細胞外囊泡。結(jié)論：首次確定了線粒體通過基于F-肌動蛋白隧道納米管從MSCs向各種眼細胞進行細胞間轉(zhuǎn)移的特征和命運，有助于表征基于MSC的眼組織再生治療方法。

案例四：長期培養(yǎng)過程中維生素C通過抑制Notch3延緩牙周膜干細胞衰老

牙周膜干細胞（PDLSCs）作為牙周組織修復和再生的潛在“種子細胞”，需要在體外進行大規(guī)模擴增。長期培養(yǎng)過程中發(fā)生的PDLSC衰老可能會損害PDLSC的治療效果。培養(yǎng)基補充劑可用于抗衰老。然而，長期培養(yǎng)過程中維生素C（Vc）處理對PDLSCs的作用和機制仍不清楚。

研究思路：在長期培養(yǎng)過程中，經(jīng)Vc處理的PDLSCs細胞保持細長的形態(tài)，較高的生長速率和遷移能力，干性和成骨分化能力。此外，低傳代次數(shù)EP vs 高傳代次數(shù)LP vs LP+Vc處理轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，Notch3在細胞衰老過程中顯著上調(diào)，Vc處理通過抑制長期培養(yǎng)過程中的Notch3延緩了PDLSCs的衰老?？傊?，Vc處理通過減少Notch3的表達來抑制PDLSCs的衰老，這可能是一種在細胞長期培養(yǎng)過程中抑制細胞衰老的簡單而有用的策略。

 

 

案例五:慢性酒精攝入和HBV通過HBx-SWELL1- 花生四烯酸信號傳導誘導脂質(zhì)代謝異常并激活HBV-Tg小鼠Treg細胞

文章題目:Chronic ethanol consumption and HBV induce abnormal lipid metabolism through HBx/SWELL1/arachidonic acid signaling and activate Tregs in HBV-Tg mice

雜志&IF:Theranostics,IF=8.579

合作單位：南開大學生命科學學院分子生物學研究所腫瘤研究室

慢性酒精攝入已成為世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問題，它在感染了乙肝病毒（HBV）的患者中促進了慢性肝病的發(fā)展?；ㄉ南┧岽x物前列腺素E2（PGE2）可激活調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）的功能。本研究旨在發(fā)現(xiàn)慢性乙醇酒精攝入導致HBV誘導的異常脂質(zhì)代謝增強和Tregs激活的潛在機制。

研究思路：通過ELISA實驗測定體內(nèi)和體外花生四烯酸代謝物PGE2和LTD4含量。通過TCGA公共數(shù)據(jù)分析篩選到與肝癌預后和診斷相關(guān)的SWELL1基因。使用siRNA減弱HepG2、HepG2.2.15肝癌細胞系和K180食管癌細胞系中SWELL1的表達，然后對HepG2細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序。Western blot分析和RT-qPCR用于檢查臨床HCC樣本和細胞系中的HBx（乙型肝炎病毒X基因）、SWELL1和轉(zhuǎn)錄因子Sp1表達。通過流式細胞術(shù)在HBV-Tg小鼠（HBV全基因組轉(zhuǎn)基因小鼠模型）中測試了慢性酒精攝入對Tregs的影響，收集酒精攝入組和對照組脾臟Tregs細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序分析。結(jié)果：體內(nèi)和體外觀察到乙醇/酒精和乙肝病毒在脂質(zhì)代謝異常中的協(xié)同作用，SWELL1（或HBx）的降低導致脂質(zhì)含量和花生四烯酸代謝產(chǎn)物減少，乙醇和SWELL1可升高小鼠和細胞系肝臟中PGE2或LTD4的水平。乙醇通過激活HBx/Sp1/SWELL1/花生四烯酸信號傳導調(diào)節(jié)了脂質(zhì)代謝異常。慢性酒精攝入顯著增加了HBV-Tg小鼠的PBL(外周血淋巴細胞) Tregs和脾臟Tregs的數(shù)量，這與體內(nèi)和體外PD-L1表達的增加一致。RNA-seq數(shù)據(jù)顯示，在以乙醇攝入小鼠或HBV-Tg小鼠的Tregs細胞中多個基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了改變。結(jié)論：長期攝入乙醇可通過HBx/SWELL1/花生四烯酸信號增強HBV誘導的異常脂質(zhì)代謝，并激活小鼠的Tregs功能。