染色質(zhì)免疫共沉淀測(cè)序技術(shù)（Chromatin Immunopreciptation with Sequencing，ChIP-Seq），作為傳統(tǒng)的研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA互作的重要工具，技術(shù)成熟，已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物的表觀遺傳學(xué)研究。但是由于ChIP的交聯(lián)作用/免疫共沉淀的局限性（如：需要大量細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差，低信號(hào)、高背景等），往往導(dǎo)致大量的精力投入?yún)s得不到預(yù)期的結(jié)果。CUT&Tag解除了傳統(tǒng)ChIP-Seq的眾多限制因素，勢(shì)必將引領(lǐng)蛋白質(zhì)—DNA互作新革命。
CUT&Tag（Cleavage Under Targets and Tagmentation）技術(shù)首次應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并于2019年4月29日《Nature Communications》上公布[1]。
什么是CUT&Tag？
CUT&Tag是一種全新的研究DNA與蛋白質(zhì)互作的技術(shù)，可以替代傳統(tǒng)的ChIP-Seq，主要用于研究目標(biāo)蛋白在染色質(zhì)上的定位，在表觀遺傳學(xué)研究等領(lǐng)域至關(guān)重要。
圖1 CUT&Tag的基本原理
CUT&Tag使用Protein A與Tn5轉(zhuǎn)座酶的融合蛋白（ChiTag），在抗體的引導(dǎo)下，Protein A與染色質(zhì)上的目的組蛋白修飾標(biāo)記、轉(zhuǎn)錄因子或染色質(zhì)調(diào)控蛋白結(jié)合，連帶的Tn5轉(zhuǎn)座酶對(duì)目的蛋白附近的DNA序列進(jìn)行切割，并將測(cè)序接頭連接到切割片段的兩端（圖1），并釋放到細(xì)胞外，PCR擴(kuò)增后直接用于高通量測(cè)序。
與ChIP-Seq相比，CUT&Tag具有哪些優(yōu)勢(shì)？
圖2 CUT&Tag與ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)流程對(duì)比[2]
（1）無需交聯(lián)、超聲打斷等步驟，節(jié)約時(shí)間；
（2）不受ChIP交聯(lián)引起的表位遮蔽影響；
（3）高分辨率和低背景信號(hào)（這是由于轉(zhuǎn)座酶原位激活切割染色質(zhì)）；（4）轉(zhuǎn)座酶切割片段兩邊序列能同時(shí)加上測(cè)序接頭，為PCR擴(kuò)增做準(zhǔn)備；
（5）細(xì)胞需求量從10,000個(gè)降至60個(gè)甚至單細(xì)胞；
（6）需要的測(cè)序深度低，節(jié)省成本。
CUT&Tag在植物上很難成功？
植物細(xì)胞細(xì)胞壁、大液泡及一些次生代謝產(chǎn)物的存在，使得這項(xiàng)技術(shù)在植物中的應(yīng)用多具挑戰(zhàn)性。但是，Tao等于2020年8月31日在《Plant Methods》上發(fā)表CUT&Tag和ChIP-Seq技術(shù)在棉花應(yīng)用的比較[2]，種種結(jié)果表明，CUT&Tag技術(shù)能夠在植物中成功應(yīng)用，且所得結(jié)果明顯優(yōu)于ChIP-Seq。
H3K4me3是一個(gè)通用的基因表達(dá)活性標(biāo)記。Tao等用棉花葉片為材料，以H3K4me3抗體設(shè)置了2個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以IgG抗體作為對(duì)照用于CUT&Tag實(shí)驗(yàn)；用H3K4me3抗體做一個(gè)ChIP，不加H3K4me3抗體的ChIP mock作為對(duì)照。分別從以下幾點(diǎn)對(duì)CUT&Tag和ChIP-Seq進(jìn)行比較。
一、 重復(fù)性
對(duì)CUT&Tag和ChIP數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CUT&Tag的兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)（CUT&Tag_H3K4me3_rep1和CUT&Tag_H3K4me3_rep2）與對(duì)照CUT&Tag_IgG相關(guān)性非常低（r=0.01，Pearson’s correlation），表明CUT&Tag實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組（背景噪音）存在顯著性差異（圖3，a），然而，ChIP_H3K4me3實(shí)驗(yàn)組與ChIP_mock具有很高的相關(guān)性（r=0.89，Pearson’s correlation），這表明，ChIP分析中信號(hào)-噪音比例很高（圖3，a），而CUT&Tag實(shí)驗(yàn)組的兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)相關(guān)性近乎完美（r=0.97，Pearson’s correlation），說明不同的生物學(xué)重復(fù)之間重復(fù)性非常好（圖3，b）。
圖3 CUT&Tag與ChIP樣品的相關(guān)性分析。
二、分辨率（測(cè)序深度）
為了分析CUT&Tag和ChIP的數(shù)據(jù)的信號(hào)分辨率，每個(gè)樣品隨機(jī)選取6M-24M的clean data，分別call peak后發(fā)現(xiàn)CUT&Tag實(shí)驗(yàn)組的兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)在clean data為6M時(shí)，peaks數(shù)目分別為42,367和46,779，ChIP僅有18,024條，當(dāng)ChIP的 clean data達(dá)到24M時(shí)，peaks數(shù)才達(dá)到40,859條（表1），這意味著CUT&Tag 6M clean data產(chǎn)生的信號(hào)分辨率相當(dāng)于ChIP 24M clean data產(chǎn)生的。這些peaks中的25,597（54.7-62.6%）個(gè)是CUT&Tag與ChIP共有的，兩個(gè)CUT&Tag生物學(xué)重復(fù)的共有peaks為37,168（79.5-87.7%；圖3，c），這也說明CUT&Tag的高重現(xiàn)性。
表1 相同測(cè)序深度下CUT&Tag及ChIP產(chǎn)生的 peaks數(shù)及FRiP值
三、 信噪比
FRiP（fraction of reads in peaks）values calculated the ratio of mapped reads that fall into peaks among all mapped reads. FRiP值越高，信噪比越高，結(jié)果也越可靠。結(jié)果表明CUT&Tag產(chǎn)生的信噪比較高（FRiP=0.7；表1）。然而，從H3K4me3信號(hào)熱圖上可以看出，在整個(gè)gene body區(qū)域CUT&Tag的信號(hào)比ChIP-Seq更強(qiáng)（圖4，a）。從相關(guān)性分析的結(jié)果可以看出，基因附近的peaks在CUT&Tag兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)之間相關(guān)性很高（r=0.94，pearson’s correlation；圖4，b），CUT&Tag和ChIP之間的相關(guān)性也較高（r=0.71，pearson’s correlation；圖4，c）。
圖4 CUT&Tag和ChIP分析蛋白質(zhì)編碼基因附近的H3K4me3信號(hào)
四、靈敏性
與熱圖顯示的強(qiáng)度一致，IGV截圖表明CUT&Tag信號(hào)在分辨率和靈敏度上的表現(xiàn)優(yōu)于ChIP（圖5，a），尤其在表達(dá)量相對(duì)低的基因中表現(xiàn)尤為明顯（如GB_A11G1394, GB_D10G1774, 和 GB_A13G1872；圖5，b）
圖5 有代表性的H3K4me4信號(hào)的IGV截圖
綜上所述，Tao等對(duì)Steven Henikoff團(tuán)隊(duì)研發(fā)的CUT&Tag技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，打破植物細(xì)胞壁、大液泡和次生代謝產(chǎn)物的壁壘，使其能夠廣泛應(yīng)用于植物染色質(zhì)的釋放。CUT&Tag與傳統(tǒng)的ChIP-Seq相比，操作簡(jiǎn)單，所需時(shí)間短，且所需細(xì)胞少，能產(chǎn)生高分辨率信號(hào)，且背景噪音低，這些優(yōu)點(diǎn)奠定了不久的將來該技術(shù)在表觀遺傳學(xué)研究中的“流量新秀”的地位。
參考文獻(xiàn)：
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