英文標題：Culture-enriched metagenomic sequencing enables in-depth profiling of the cystic fibrosis lung microbiota
機構(gòu)：加拿大卡爾加里大學微生物學、免疫學和傳染病學系
發(fā)表期刊：Nature Microbiology
影響因子：15.54
發(fā)表時間：2020 Jan 20
摘要
作者將擴增子測序與富集培養(yǎng)宏基因組測序相結(jié)合研究人類微生物群落。以肺囊性纖維化為例，平均培養(yǎng)了82.13%的可操作分類單元（OTUs），占痰液樣本直接測序所鑒定的相對豐度的99.3%，更重要的是，與直接測序相比，富集培養(yǎng)方法鑒定的OTUs多了63.3%。作者開發(fā)了平板覆蓋算法（PLCA），以確定富集培養(yǎng)平板的代表性子集，從而在該子集上進行宏基因組研究。與不依賴培養(yǎng)的方法相比，可以恢復更多的物種多樣性（包含更好的低豐度物種的組裝基因組，MAGs），更長的重疊群和更好的功能注釋結(jié)果。PLCA算法也可以應用于此前發(fā)布的腸道菌群數(shù)據(jù)集，富集培養(yǎng)分子圖譜可以更好的了解微生物菌群在人類健康和疾病中的作用。
背景介紹
擴增子測序（如16S rRNA基因）簡單快速地鑒定出微生物菌群組成和相對豐度，而宏基因組測序除了物種之外，還可以評估群落的基因組分、潛在功能，測序數(shù)據(jù)的有效性，取決于短序列拼接成重疊群的情況。拼接質(zhì)量受菌群的復雜度、測序技術、宿主DNA污染比例等影響。宏基因組測序?qū)τ谒拗鱀NA比例較高的樣本類型（如皮膚、組織、呼吸道）來講是一個挑戰(zhàn)。
實驗方法
基于作者之前的研究（肺囊性纖維化患者的痰液樣本富集培養(yǎng)擴增子測序鑒定到48科細菌，其中43科可以培養(yǎng)），收集到的樣本分別在有氧和厭氧條件下，經(jīng)過13種不同的培養(yǎng)基富集。同時，對這些樣本直接進行16S rRNA測序，富集培養(yǎng)后的共26個樣本也進行16S測序，同時挑選了8個富集后的樣本進行宏基因組測序。
圖1 富集培養(yǎng)宏基因組測序工作流程
實驗結(jié)果
肺囊性纖維化痰液微生物菌群大多是可培養(yǎng)的，富集培養(yǎng)增加OTU恢復率
作者判斷OTU可培養(yǎng)的條件：1）至少10條序列；2）至少1個富集板中回收到且豐度比例至少為0.01%。直接測序鑒定到的OTU中82.13%是可培養(yǎng)的，這些可培養(yǎng)的在所有直接測序的樣本中平均豐度比例為99.3%（圖2a），富集培養(yǎng)擴增子測序比直接測序獲得更多的OTUs（圖2b），如樣本1恢復到49個OTUs，其中42個在富集培養(yǎng)中也恢復到，富集培養(yǎng)還恢復了額外的124個OTUs（圖2a）。
圖2 肺囊性纖維化痰液微生物菌群大多是可培養(yǎng)的
培養(yǎng)OTU恢復率取決于培養(yǎng)基類型和是否有氧
培養(yǎng)基類型和培養(yǎng)環(huán)境對于微生物菌群多樣性是重要的。富集培養(yǎng)和直接16S測序結(jié)果中物種分布和β多樣性結(jié)果表明有氧和厭氧條件促進了不同的物種恢復（圖3a,b）。不同培養(yǎng)基類型的物種進行聚類顯示選擇性培養(yǎng)和非選擇性培養(yǎng)的重要性（圖3c），有些屬的生長模式也存在OTU依賴差異（如普氏菌屬，圖3d）。作者在臨床實驗室常用的4種典型培養(yǎng)條件的基礎上，擴展了培養(yǎng)條件，獲得將近2倍的OTUs（圖3e）。富集培養(yǎng)的另一個優(yōu)點是可以從凍存細菌中回收感興趣的微生物。嗜麥芽窄食單胞菌從兩個凍存的脫脂牛奶塊中分離得到，其相對豐度比例很低（1.3%和1.5%），牛奶塊在特定的培養(yǎng)基類型培養(yǎng)（圖3f）。
圖3 通過培養(yǎng)富集物種分類多樣性增加
PLCA算法為培養(yǎng)富集的宏基因組測序提供信息
肺部蘊藏了微生物菌群，每個個體是有差異的，雖然不同的培養(yǎng)條件是捕獲每個個體多樣性的必要條件，但是并不意味著收集到的每個樣品都需要進行培養(yǎng)富集，這對其他人體部位菌群同樣適用，如腸道中有很多微生物在人群中普遍存在，而有些微生物則對某些個體來講是特異的。我們不能預先知道哪些樣品可以體現(xiàn)菌群狀態(tài)，但我們可以采用16S rRNA測序，以確定菌群物種分布，來選擇哪些樣品適合進行富集培養(yǎng)。
作者采用了PLCA算法，來決定需要進行富集培養(yǎng)宏基因組測序的最小樣品數(shù)，算法對任何含有大部分可培養(yǎng)富集的菌群生態(tài)均適用。PLCA算法有兩個版本，從頭 PLCA不依賴于直接測序結(jié)果再現(xiàn)富集培養(yǎng)菌群，而校正PLCA側(cè)重于直接測序結(jié)果中OTU的修復，這取決于是否都對原始樣品的菌群組成感興趣。采用這兩種算法，數(shù)據(jù)集凸顯了不同樣本的獨特性：從頭PLCA顯示，每個樣本具有獨特的平板集，并且每個培養(yǎng)條件對每個樣本都是必要的；校正PLCA顯示對數(shù)據(jù)集中樣本進行富集培養(yǎng)宏基因組測序是很有必要的（圖4a,b）。
圖4 PLCA算法確定了富集培養(yǎng)宏基因組測序的最佳平板組
富集培養(yǎng)宏基因組測序提供了更好的分類和功能分辨率
作者選擇代表性樣品，同時采用PLCA算法的兩個版本。從頭PLCA和校正PLCA分別顯示需要進行5個和3個富集培養(yǎng)平板的宏基因組測序。通過宏基因組樣本合并組裝、binning和物種注釋，比較兩種算法的實驗結(jié)果和預期結(jié)果。從頭PLCA恢復10個bins，與PLCA閾值上的10個OTUs物種比對結(jié)果一致，另有6個閾值以下的物種，校正PLCA恢復了預期10個預期的OTUs，另有14個閾值下的OTUs（圖4c）。
對從頭PLCA、校正PLCA和直接宏基因組測序的數(shù)據(jù)集分別進行合并組裝、binning，定義完整度≥70%和污染度＜10%的為MAG，閾值下為non-MAG。其中從頭校正PLCA得到7MAGs和9個non-MAG bins，校正PLCA得到12個MAGs和12個non-MAG bins，而直接宏基因組測序僅得到1個MAG和1個non-MAG bin（圖5）。直接測序的序列比對富集培養(yǎng)的bins，在從頭PLCA和校正PLCA中均只在1個bin中觀察到顯著覆蓋（圖5,藍點）。直接測序獲得2個bins均注釋到假單胞菌的種，富集培養(yǎng)的bins注釋物種多樣性增加（14個屬，圖5）
通過富集培養(yǎng)獲得的分類學多樣性的增加直接轉(zhuǎn)化為該微生物群落功能信息的增加（圖6）。富集培養(yǎng)測序在直系同源蛋白簇（COGs）、毒力基因、抗生素抗性基因、CRISPRs和次級代謝功能方面獲得更大的多樣性和功能鑒定數(shù)量。先前的研究已經(jīng)證實囊性纖維化氣道以及整個人類微生物群中存在單一物種的異質(zhì)性群體。作者通過鑒定基因單倍型來計算每個宏基因組bin的遺傳變異性（圖6d）。在一些宏基因組bins中，作者鑒定到一個一致的和少量的基因單倍型，表示這個bin代表一個單一的基因組群體（即一個菌株）。在大多數(shù)bins中，作者觀察到大量的單倍型多樣性，指示異質(zhì)性群體，即多菌株。不出所料，這些區(qū)域中每個基因的單倍型數(shù)量是多種多樣的，這表明細菌基因組內(nèi)進化壓力的已知范圍。平均而言，假單胞菌屬種中鑒定出更多的基因單倍型，富集培養(yǎng)的bins比直接測序更多。然而，直接測序鑒定了大量的普遍存在的單倍型基因離群值。Bin的完整性與平均單倍型頻率沒有相關性。
圖5 項目數(shù)據(jù)中第一批樣本直接測序和腹肌培養(yǎng)測序的MAG和non-MAG bins結(jié)果
圖6 直接和富集培養(yǎng)宏基因組測序的物種和功能多樣性結(jié)果
討論
測序成本的降低和測序技術的增加，徹底改變了我們研究人類微生物群的方式，從而使人們對群落及其與健康和疾病之間的關系有了更深入的了解。腸道是目前研究最深入的人體微生物組，很多研究將其與各種疾病和狀況聯(lián)系在一起。皮膚、活檢組織、口腔微生物樣本等許多重要的與人類相關的群落具有高比例的非微生物DNA，這些樣本的宏基因組測序數(shù)據(jù)由于宿主污染，必須通過比對過濾掉大部分序列，意味著只有群落中高豐度比例的物種可以被組裝成MAGs。作者論證了與傳統(tǒng)培養(yǎng)技術相關聯(lián)的富集宏基因組測序可以提高群落的分辨率，并且為了最有效的結(jié)合富集培養(yǎng)和直接測序，作者設計了PLCA算法，其確定了對于重現(xiàn)原始菌群（擴增子測序），富集培養(yǎng)宏基因組測序很有必要。
富集培養(yǎng)測序與直接測序相結(jié)合觀察到更多的物種多樣性并且更深入的了解與人類相關的微生物群落，更好的了解每種微生物的基因組成。此外，將這些微生物進行培養(yǎng)，我們可以進行體外機制的研究，并且可以在人類健康和疾病的背景下，更好的了解這些群落。
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