導讀
研究背景：
人乳頭瘤病毒（HPV）是宮頸癌的主要原因，HPV16和18是全球兩種流行的高危HPV類型。宮頸癌是女性中第二大常見的惡性腫瘤。每年有570,000名女性被診斷出患有宮頸癌，并且有311,000名女性死于這種疾病。盡管已知持續(xù)的HPV感染會導致宮頸癌，但目前尚不清楚HPV如何誘發(fā)癌變，以及在該過程中到底發(fā)揮什么重要的功能。HPV感染后，HPV蛋白E6和E7被表達，其抑制腫瘤蛋白p53和視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白，破壞細胞增殖和許多其他生物學過程，并誘發(fā)宮頸癌。此外，HPV DNA也可能整合到人類DNA中，這是致癌過程中的早期重要事件。另外，癌癥的進展可以通過病毒DNA整合入抑癌基因來解釋。這種整合入宿主DNA會使那些基因失活，從而導致生長不受控制。了解病毒的致癌作用對于HPV陽性癌癥的臨床治療至關(guān)重要。
結(jié)論：
作者通過Nanopore和Illumina測序?qū)ο惹鞍l(fā)表的樣品的整合位點進行了重新測序。在對結(jié)果進行分析之后，得出了三點結(jié)論：首先，從所有三個數(shù)據(jù)集（即，Nanopore，Illumina和已發(fā)布的數(shù)據(jù)）中找到了19個先前發(fā)布的整合位點中的13個，表明這些元素之間具有很高的重疊率和可比性；其次，與先前發(fā)表的論文相比，Nanopore和Illumina數(shù)據(jù)確定了66個獨特的整合位點，其中13個已通過Sanger測序驗證，這表明與公開數(shù)據(jù)相比，作者的結(jié)果對整合位點的檢測靈敏度更高；第三，作者建立了可用于通過納米孔測序數(shù)據(jù)檢測HPV整合位點的pipeline，并且無需進行糾錯分析?？偠灾c現(xiàn)有的Illumina數(shù)據(jù)分析pipeline方法相比，測試了一種新的納米孔數(shù)據(jù)分析方法，并證明了該方法在整合位點檢測中是可靠的，所需的測序數(shù)據(jù)更少。它提供了有力的證據(jù)和工具來支持納米孔在病毒狀態(tài)識別中的潛在應(yīng)用。
材料與方法
實驗結(jié)果
一、數(shù)據(jù)質(zhì)控
作者通過對目標區(qū)域捕獲后進行文庫構(gòu)建，分別進行Nanopore和Illumina測序，分別獲得130.2 Mb和1.64 Gb的clean?reads（圖1）。
?圖1
二、通過Nanopore和Illumina數(shù)據(jù)鑒定HPV整合位點
作者構(gòu)建Nanopore分析pipeline（圖2A），通過Blast與人和HPV16病毒基因組進行比對，共識別339個整合位點，通過過濾篩選最終剩余60個位點進行后續(xù)的分析。Illumina測序共獲得1718個整合位點，篩選reads覆蓋度大于3的位點54個進行后續(xù)分析。
?圖2
所有斷點在染色體上的分布見圖3A。染色體chr20、chr2、chr6分別由12、11和8個斷點，chr1和chrX均存在7個斷點，其余染色體斷點分布均在5以下。在每個位點上的reads覆蓋度從2~406不等，大約有31.7%以上的位點覆蓋深度在10以上。在top5的覆蓋深度位點中3個位于chr20（HPV16:2804,chr20:32516985 (406 reads)；HPV16:7139,chr20:32478733(169 reads)；HPV16:4276,chr20:32502143(51reads)），2個位于chrX（HPV16:5534,chrX:20464412 (132 reads)；HPV16:3163,chrX: 20462930 (50 reads)）。
圖3B展示了60個位點在HPV基因組上的分布，L2基因中有18個，L1中有12個，E1中有11個，E2中有7個，其他每個基因（E6，LCR，E5和E7）上小于4個。
在人基因組上，有38個位點在基因間區(qū)，18個位于內(nèi)含子區(qū)域，2個位于非編碼區(qū)域，1個位于外顯子區(qū)域，1個位于downstream區(qū)域。
進一步分析人基因組上的位點分布，在chr20染色體上的12個位點中，有10個在基因CHMP4B和RALY-AS1之間，有一個位于KIF3B和ASXL1之間，最后一個位于基因ATRN的內(nèi)含子區(qū)域。除了chr20染色體外，其他染色體上也有明顯的位點聚集趨勢，例如，chrX染色體上的6個位點在基因RPS6KA3和CNKSR2之間，chr6染色體上的3個位點位于基因CAGE1的內(nèi)含子或者downstream區(qū)域。
圖3
三、在不同數(shù)據(jù)集中的位點差異
在Illumina測序獲得的54個整合位點中，有19個與之前報道的相符。整合所有位點并做韋恩圖（圖4），有13個位點是3種數(shù)據(jù)（Nanopore、Illumina、published）都存在的，這表明不同平臺間重復性很好。共有18個位點同時出現(xiàn)在Nanopore和Illumina中，三個位點同時出現(xiàn)在納米孔測序和以前發(fā)表的論文中，只有一個位點在Illumina和已發(fā)表的論文重疊。在兩個平臺中確定的整合位點中，一些斷點具有高度豐富的reads數(shù)，例如HPV16：2804，chr20：32516985，Nanopore結(jié)果中有406個reads，Illumina結(jié)果中有1439個reads。其他斷點的reads數(shù)很少，例如HPV16：4250，chr21：97550764，其中Nanopore結(jié)果中有兩個reads，而Illumina結(jié)果中只有四個reads。
除了重疊的位點外，每個平臺都有自己獨特的整合位點。 Nanopore、Illumina和文獻中，分別擁有26、22和2個唯一的整合位點。在Nanopore識別的26個位點中，其中6個reads支持度在6以上。因此，在Illumina，Nanopore和文獻這三種方法確定的整合位點中，Nanopore具有相對可靠的豐度，可以確定準確的整合位點。
?圖4
作者為了測試數(shù)據(jù)確定的新整合位點的準確性，利用Sanger測序進行驗證?？偣策x擇了14個整合位點進行驗證，并對13個進行PCR擴增并成功測序，表明這些整合位點的真正陽性，這些陽性位點大多由Nanopore和Illumina平臺鑒定。
圖5
四、受影響的基因功能分析
合并3種不同平臺的整合位點，并對整合完的83個位點進行注釋，并進行了進一步的功能分類和途徑分析。這些基因分為八個生物學過程，包括RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控（6個基因），RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄負調(diào)控（6個基因），RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（5個基因）， RNA聚合酶II啟動子的轉(zhuǎn)錄（4個基因），視黃酸受體信號傳導途徑的負調(diào)控（2個基因），皮膚屏障的建立（2個基因），近端/遠端模式形成（2個基因）和胚胎肢體形態(tài)發(fā)生（2個基因）六個胞質(zhì)（13個基因），核質(zhì)（8個基因），胞外外泌體（8個基因），蛋白質(zhì)結(jié)合（6個基因），DNA結(jié)合（2個基因）和肌動蛋白結(jié)合（2個基因）。
討論
數(shù)據(jù)表明，大多數(shù)整合位點存在于人類基因組的基因間區(qū)域中，與先前的研究一致。由于鑒定出人類基因組中有很大一部分（60％）的基因間區(qū)域，研究結(jié)果確定了約40％的整合位點位于人類基因組的基因間區(qū)域中，沒有顯著差異。因此，可以得出結(jié)論，整合位點在人類基因組中的分布方式受到基因組功能結(jié)構(gòu)性質(zhì)的影響。另外作者還發(fā)現(xiàn)整合發(fā)生在非編碼RNA中，它起著許多重要的功能，例如lncRNA與p53蛋白相互作用。插入ncRNA可能會導致更嚴重的功能中斷。其中HPV有插入的傾向，例如腫瘤蛋白63（TP63），它在致癌作用中起著非常重要的作用。
在這項研究中，作者確定了兩個基因CHMP4B和RALY-AS1。整合簇的趨勢非常強，在76個獨特的整合位點以及其他幾個染色體區(qū)域中有10個整合位點。為什么病毒會整合到幾個特定區(qū)域，并且是隨機的還是特定的？需要進一步的研究來回答這些問題。
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