2021年7月2日，上海交通大學醫(yī)學院與北京百邁客生物科技有限公司合作的文章發(fā)表在NEURO-ONCOLOGY（IF 12.3）上，研究團隊利用RNA-seq、ATAC-seq和Hi-C檢測技術(shù)，揭示了骨微環(huán)境在脊索瘤發(fā)生中的作用，并將CA2蛋白確定為脊索瘤的治療新靶點，此外，本研究還發(fā)現(xiàn)鹽酸多佐胺可能為脊索瘤治療提供新的選擇。以下是對該文章的詳細解讀。
導讀
脊索瘤是一種罕見的間充質(zhì)惡性腫瘤，復發(fā)率高，致瘤機制不明確。遺傳物質(zhì)的改變、表觀遺傳調(diào)節(jié)因子和染色質(zhì)空間構(gòu)象在脊索瘤的發(fā)生和發(fā)展中起關鍵作用。本研究利用RNA-seq、ATAC-seq和 Hi-C技術(shù)對脊索瘤和人髓核（HNP）進行多組學檢測，并結(jié)合影像學檢查和臨床信息，揭示了骨微環(huán)境在脊索瘤中的重要作用，并且發(fā)現(xiàn)CA2在脊索瘤中高表達，但在HNP中幾乎不表達。本研究還發(fā)現(xiàn)可通過敲除基因或使用鹽酸多佐胺等藥物抑制CA2的表達，從而抑制脊索瘤細胞生長和遷移，此外，鹽酸多佐胺還通過阻斷骨髓單核細胞向破骨細胞的分化來調(diào)節(jié)骨微環(huán)境。綜上，本研究通過結(jié)合多組學檢測技術(shù)，最終揭示了骨微環(huán)境在脊索瘤發(fā)生中的作用，并將CA2蛋白確定為脊索瘤的治療新靶點， 此外，本研究還發(fā)現(xiàn)鹽酸多佐胺可能為脊索瘤治療提供新的選擇。
研究背景
脊索瘤是一種罕見的間充質(zhì)惡性腫瘤，主要發(fā)生在中軸骨，如顱底蝶枕部和骶尾部。在治療上，常規(guī)劑量的放療和化療對它沒有作用，因此手術(shù)是主要治療方法 ，但其復雜的解剖結(jié)構(gòu)和相對較大的腫瘤體積使得腫瘤組織不能被切除干凈，導致局部復發(fā)率高。因此，迫切需要探索脊索瘤潛在的致瘤機制和治療新靶點。
在病理學上，脊索瘤起源于椎體內(nèi)的脊索殘留物，由胚胎晚期不完全擠壓引起。脊索瘤的發(fā)生涉及到幾個基因的異常表達，例如TBXT、CDKN2A和LYST。除了基因表達改變外，染色質(zhì)可及性的改變，以及染色體構(gòu)象的改變，如通過染色質(zhì)折疊將線性距離較遠的啟動子、增強子和其他順式調(diào)控區(qū)域聚集在一起等，這些改變對基因的調(diào)控也至關重要。
本研究利用RNA-seq、ATAC-seq和 Hi-C技術(shù)在脊索瘤和脊索來源的髓核中綜合分析了基因表達情況和染色質(zhì)可及性，結(jié)果表明骨微環(huán)境和骨骼系統(tǒng)發(fā)育在脊索瘤發(fā)生中的潛在作用。此外，通過比較差異表達基因（DEG），發(fā)現(xiàn)CA2在脊索瘤中高表達，其抑制劑鹽酸多佐胺可靶向作用于CA2，從而抑制脊索瘤細胞增殖、遷移、致瘤性和破骨細胞分化。
實驗方法
材料：細胞系（原代HNP細胞來自24周胎齡的流產(chǎn)胎兒的原代培養(yǎng)細胞；脊索瘤細胞系CH22獲自脊索瘤基金會；骨髓單核細胞（BMM）來自C57/BL6小鼠股骨）
方法：RNA-seq、ATAC-seq和Hi-C
研究結(jié)果
1、HNP和CH22細胞的差異基因分析（DEG）
對CH22和HNP細胞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較分析，每種細胞類型內(nèi)的重復間具有高度相關性（r2=0.9937 和 r2=0.9841）。與HNP相比，在CH22中鑒定了3,122個上調(diào)的基因和1,810個下調(diào)的基因，熱圖和火山圖顯示了幾個重要的DEG，例如GDA、TBXT、CDKN2A和CDKN2B（圖1A、B）。GO分析顯示DEG與軸突發(fā)育和骨骼系統(tǒng)發(fā)育相關（圖1C）；KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT和MAPK信號通路在脊索瘤腫瘤發(fā)生中富集。
圖1 RNA-seq和ATAC-seq數(shù)據(jù)分析
2、HNP和CH22細胞的染色質(zhì)差異可接近性區(qū)域分析（DAR）
與HNP相比，在CH22中確定了313個增加的DAR 和 1,749 個減少的DAR。DAR的motif分析顯示CTCF、Nkx2-2、Tcfe2a_2、MED-1 和 E2A motif在CH22中高度富集。還確定了DAR中的DEG，如GDA、TBXT和PAX1（圖 1D）。GO分析顯示DAR中的基因與骨骼系統(tǒng)發(fā)育有關（圖 1E）；KEGG富集分析顯示這些基因富集在PI3K-AKT信號通路上。
3、HNP與CH22細胞間染色體相互作用差異
對CH22和HNP進行Hi-C染色體構(gòu)象捕獲測序，共獲得1027和8.64億個有效相互作用對。相互作用類型分析顯示，HNP和CH22的平均順反比分別為1.815和0.69，表明CH22中的染色體間相互作用更強。
染色體相互作用頻率（IR）能夠反映基因組區(qū)域在細胞核中的相對位置，與轉(zhuǎn)錄活性相關。在HNP的IR熱圖中，觀察到在富含基因的短染色體（chr16、17、19-22）中IR較高，尤其是在chr21和chr22之間。在CH22中，chr3和chr15、chr5和chr20、chr2和chr4、chr9和chr13、chr12和chr16之間的IR更高，短染色體（chr16-22）之間的IR更低。IR強度和DEGs/DARs無顯著相關性（p = 1）。
4、HNP和CH22細胞之間的結(jié)構(gòu)變異
與HNP 相比，在CH22中發(fā)現(xiàn)了一些大的染色體結(jié)構(gòu)變異，表明脊索瘤發(fā)生中會出現(xiàn)的幾個染色體易位事件，例如chr2和chr4（圖 2A）。在CH22中鑒定了8個明顯的結(jié)構(gòu)變異區(qū)域，如在Hi-C中觀察到兩個明顯的相互作用區(qū)域R5（在chr2 R1和Chr4 R3之間）和R6（在chr2 R2和chr4 R4之間）。H2信號表明chr2和chr4之間在P1（chr2：55,540,000）和P3（chr4：156,520,000）位置發(fā)生了相互易位。位置P1和P2 (chr2:160,550,000) 之間的強相互作用信號（H1）表明Chr2中的倒位區(qū)域與易位區(qū)域相鄰（圖 2B）。此外，還發(fā)現(xiàn)了chr12中更強的染色體內(nèi)相互作用信號（CNV 區(qū)域）（18,040,000-90,120,000bp，圖 2C）和chr9中的缺失區(qū)域（21,640,000-25,360,000bp）。在 CNV 區(qū)域，有187個DEG，包括一些普遍報道的與脊索瘤相關基因，例如KRT8和KRT18（圖 2D），臨床樣本進一步證實了它們在脊索瘤中高表達。在缺失區(qū)域，鑒定了9個DEG，包括腫瘤抑制基因，如CDKN2A和CDKN2B（圖 2E）?；贕O和KEGG分析，發(fā)現(xiàn)CNV區(qū)域中的基因與骨骼系統(tǒng)發(fā)育和癌癥中的蛋白聚糖通路相關（圖 2F）。
圖2 HNP和CH22細胞的結(jié)構(gòu)變異分析
5、HNP和CH22細胞之間的compartments分析
常染色質(zhì)和異染色質(zhì)可分為兩個區(qū)域，定義為compartments“A”和“B”。 脊索瘤A/B compartments的基因組和表觀遺傳特征表明，compartments A與較高的基因密度、轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域相關，而compartments B具有較差的基因密度、與轉(zhuǎn)錄非活躍區(qū)有關。
在腫瘤發(fā)生過程中，染色質(zhì)compartments會進行轉(zhuǎn)換。與HNP相比，CH22的每條染色體中都發(fā)現(xiàn)了compartments轉(zhuǎn)換，尤其是在chr1、9、13-16和22（圖3A）。HNP中9.99%的compartments A在CH22中為compartments B，6.06%的compartments B在CH22中為compartments A，從A到B的轉(zhuǎn)換中基因的表達顯著下調(diào)（p=1.08 e-74 ），反之亦然（p=4.11 e- 47 ）。
進一步標記了441個基因從compartments B切換到compartments A（376 個下調(diào)和 65 個上調(diào)）和341個基因從compartments A 轉(zhuǎn)換到compartments B（38 個下調(diào)和 303 個上調(diào)，圖3B、C)。GO和KEGG分析表明它們與骨骼系統(tǒng)發(fā)育和致癌途徑有關，如癌癥中的PI3K-AKT信號和蛋白聚糖通路。
圖3 細胞特異性compartments、TAD邊界和Loop分析
6、HNP和CH22細胞之間特異TAD邊界分析
compartments由TAD組成，它們在細胞類型和物種中是保守的。在腫瘤發(fā)生過程中，被破壞或新形成的TAD邊界可能導致增強子和啟動子之間的相互作用，并調(diào)節(jié)基因表達。本研究在HNP中檢測到6,677個TAD，在CH22中檢測到4,856個TAD。TAD 邊界處基因和染色體開放富集區(qū)域的富集程度大于TADs內(nèi)部。
研究確定了1,617個HNP特異邊界和437個CH22特異邊界，同時確定了位于HNP和CH22特異邊界的588和62個DEG，包括CA3、RAB17和TRIB2（圖3D，E）。GO和KEGG分析表明這些DEG與細胞外基質(zhì)和細胞因子-細胞因子受體相互作用有關。
7、HNP和CH22細胞之間的特異Loop分析
在基因調(diào)控中，增強子通過染色質(zhì)Loop激活啟動子。本研究在HNP和CH22中分別檢測到10,048和12,170個Loop，中位數(shù)長度為100,000 bp。通常認為，與增強子相關的Loop可以增加基因表達。本研究在HNP和CH22中分別鑒定了3,515和4,187個啟動子-增強子loop（圖3F）。其中，ATAC-seq峰分別支持2,495 和1,732個。此外，在CH22中發(fā)現(xiàn)了比HNP更多的啟動子loop和增強子loop。
兩種細胞類型中的loop是高度保守的，分別鑒定了1,226個HNP特異性loop和3,348個CH22特異性loop（圖 3G）。在HNP特異性loop中，發(fā)現(xiàn)了45個在CH22中上調(diào)表達的基因和41個在CH22中下調(diào)的基因，以及CH22特異性loop中的75個CH22上調(diào)基因和129個CH22下調(diào)基因，例如 GDA、EEF1A2和ADAM12（圖3H)。GO 和 KEGG 分析表明這些DEGs 與軸突發(fā)育、癌癥中的蛋白聚糖通路和 PI3K-AKT 信號通路有關。
8、HNP與CH22細胞的多組學聯(lián)合分析
為了探索潛在的治療靶點，本研究結(jié)合了位于CH22和HNP細胞之間的compartments、細胞特異性TAD和loop中的重疊的DEG，鑒定到了兩個重疊的DEG（圖 3I），即CA2和THNSL2?；贕O和KEGG功能注釋，發(fā)現(xiàn)骨骼系統(tǒng)發(fā)育在脊索瘤發(fā)生中的重要作用。此外，根據(jù)427名脊索瘤患者的影像學數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)所有脊索瘤均在骨結(jié)構(gòu)中被識別，但并非源自HNP。在四個外部數(shù)據(jù)庫中，骨骼是脊索瘤發(fā)生最常見的位置，比例分別為73.98%、79.18%、86.31% 和 86.06%?？偟膩碚f，在3169例脊索瘤患者中，2439個脊索瘤位于骨內(nèi)，410個位于腦脊髓神經(jīng)系統(tǒng)，159個位于鼻咽和蝶竇，147個位于軟組織，6個位于胸腔，8個位于不明原發(fā)部位。
研究結(jié)論
本研究采用多組學技術(shù)，對脊索瘤和HNP中的基因表達、染色質(zhì)可及性和染色質(zhì)空間結(jié)構(gòu)進行了綜合比較分析，并進行了大樣本量驗證。結(jié)果不僅證明了骨微環(huán)境與脊索瘤發(fā)生的相關性，而且還確定了一個新的治療靶點（CA2）。此外，研究結(jié)果還表明鹽酸多佐胺有望成為脊索瘤的一種潛在治療選擇。
參考文獻
Meng T, Huang R, Jin J, et al. The comparative integrated multi-omics analysis identifies CA2 as a novel target for chordoma. Neuro Oncol. 2021 Jul 2:noab156. doi: 10.1093/neuonc/noab156
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