【原核表達(dá)篇】蛋白質(zhì)譜鑒定

原核表達(dá)（Prokaryotic expression) 顧名思義是在原核生物體內(nèi)進(jìn)行的蛋白表達(dá)。一般是通過(guò)基因克?。℅ene cloning）技術(shù)在體外構(gòu)建好原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化到原核生物的細(xì)胞中，添加誘導(dǎo)劑進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá),這是目前分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的方法。

原核表達(dá)載體

體外誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)需要將攜帶有目的基因片段的原核表達(dá)載體導(dǎo)入表達(dá)菌株中，通過(guò)添加適量的誘導(dǎo)劑，使目的蛋白的表達(dá)量升高。

蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

1.原核表達(dá)方案：

將原核表達(dá)載體導(dǎo)入原核生物表達(dá)菌株中，將平板上的單克隆先接種至0.2 ml的抗性液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。進(jìn)而轉(zhuǎn)接到5 ml抗性液體培養(yǎng)基中，待菌液OD值為0.6-0.8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)。通常情況下菌液OD值0.6最佳，OD值超過(guò)1.0后，菌體老化，不適合進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。加入IPTG誘導(dǎo)劑，100mM的IPTG溶液, 添加的比例為1:100，1M濃度的IPTG溶液, 添加的比例為1:1000，此時(shí)TPTG終濃度為1mM。建議在添加誘導(dǎo)劑前吸取1 ml 未誘導(dǎo)的菌液作為對(duì)照，有些情況下未誘導(dǎo)會(huì)有本底滲漏表達(dá)，表達(dá)量很低。

2.融合蛋白存在形式的影響因素：

溫度：一般來(lái)說(shuō)，大腸桿菌最適合的培養(yǎng)溫度是37℃，但在此溫度下容易使得蛋白翻譯速度太快，來(lái)不及正確折疊，形成以包涵體形式表達(dá)的蛋白。上清是具有生物學(xué)活性的蛋白，后續(xù)制備抗體優(yōu)先選擇以上清形式表達(dá)的蛋白。優(yōu)化：可以嘗試做溫度梯度，16℃， 20℃，24℃，30℃。嘗試低溫誘導(dǎo)。
誘導(dǎo)劑：誘導(dǎo)劑濃度一般可以嘗試0.2 mM 、0.4 mM、0.6 mM、0.8 mM、1.0 mM 1.5 mM、2 mM的IPTG濃度, 濃度太高容易對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。
誘導(dǎo)時(shí)間：嘗試 3 h、6h、8h、10h、12h, 依據(jù)不同蛋白所決定，誘導(dǎo)過(guò)程中添加適量抗生素可能有好的效果。根據(jù)每個(gè)蛋白的不同，誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)于表達(dá)量的影響不盡相同。

3.表達(dá)形式：超聲破碎后離心分為兩部分，一部分是上清，一部分是沉淀，上清具有生物學(xué)活性。沉淀不具有生物學(xué)活性。

4.蛋白定量：SDS-PAGE蛋白膠可以觀測(cè)蛋白的分子量和濃度，蛋白Marker是分子量指示大小，估計(jì)marker條帶大小估算目的蛋白分子量大小。用BSA標(biāo)準(zhǔn)品溶液定量蛋白，可以估測(cè)蛋白濃度。

M: marker 1:0.5 mg/ml BSA(上樣量10 μL）2：0.5 mg/ml 目的蛋白溶液(上樣量2 μL） 3-7：0.5 mg/ml 目的蛋白溶液（上樣量10μL）

5.蛋白定性

產(chǎn)品概述

利用LC-MS/MS蛋白鑒定技術(shù)對(duì)膠條樣本（即SDS-PAGE樣本）、IP、co-IP、Pull-down等復(fù)雜樣本進(jìn)行鑒定。

技術(shù)原理

質(zhì)譜一般由離子源（Ion source）、質(zhì)量分析器（Mass analyzer）和離子檢測(cè)器（Detector）三部分組成。傳統(tǒng)的質(zhì)譜僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，但隨著新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF)和電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)等，質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)為蛋白質(zhì)分析提供了一種新的途徑。現(xiàn)在蛋白質(zhì)組學(xué)基本研究手段是：以生物質(zhì)譜技術(shù)為核心，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行大規(guī)模、高通量分離、鑒定和分析。
蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定的基本原理是用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成肽段混合物，經(jīng)MAILDI或ESI等軟電離手段將其離子化，然后通過(guò)質(zhì)量分析器將具有特定質(zhì)核比的肽段離子分離開(kāi)來(lái)。通過(guò)實(shí)際譜圖和理論上蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)蛋白酶消化后產(chǎn)生的一級(jí)質(zhì)譜峰圖和二級(jí)質(zhì)譜峰圖進(jìn)行的比對(duì)，進(jìn)行蛋白鑒定。

實(shí)驗(yàn)流程

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

高通量，一次可鑒定多種蛋白質(zhì)；

靈敏度高，可檢測(cè)樣品濃度較低的膠點(diǎn)；

通用性強(qiáng)，可分析蛋白質(zhì)條帶、免疫共沉淀洗脫液等多種形式的樣品。

液相與質(zhì)譜連用，自動(dòng)化操作，分析速度快，分離效果好。

應(yīng)用范圍

蛋白質(zhì)膠點(diǎn)鑒定

蛋白質(zhì)膠條鑒定

蛋白混合溶液鑒定

蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)

除了蛋白定性鑒定，百邁客還提供以下產(chǎn)品：