全長微生物多樣性+代謝組聯(lián)合分析助力發(fā)現(xiàn)細菌接種劑與蔗糖改良劑帶來的細菌群落變化與R.palmatum L.生長之間的關系

文獻信息

期刊：International Journal of Molecular Science

影響因子：5.923

發(fā)表時間：2022.02.01

合作單位：中國科學院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院

研究方法：全長微生物多樣性（16S+ITS）

摘要

2022年2月，中國科學院西北生態(tài)環(huán)境與資源研究所在《International Journal of Molecular Science》發(fā)表題為“Bacterial Inoculant and Sucrose Amendments Improve the Growth of?Rheum palmatum?L. by Reprograming Its Metabolite Composition and Altering Its Soil Microbial Community”的研究論文，該論文主要研究了（1）細菌接種劑和蔗糖聯(lián)合使用對R. palmatum?L.的影響；（2）聯(lián)合接種對土壤性質和土壤微生物的影響；（3）聯(lián)合接種后根際微生物變化及其與R. palmatum?L.生長變化的關聯(lián)。

研究背景

根際被定義為與植物根系相關的狹窄土壤區(qū)域（<2mm），它是土壤肥料核心PGPM（Plant Growth-Promoting Microbes，促進植物生長）定植的地點，與植物生長發(fā)育具有重要關聯(lián)。Bacillus是目前最為廣泛報道的PGPM，可通過直接作用促進植物生長，如產生生物化合物（例激素吲哚-3-乙酸（IAA）以及亞精胺等），還可以通過微生物之間的協(xié)同及拮抗作用間接促進植物生長。但是由于土壤通常是碳限制狀態(tài)，在這樣的情況下，只有不到5%的細菌處于活躍狀態(tài)，通過向土壤中添加蔗糖等小分子碳可以影響細菌的直接能源，從而促進PGPM效應。

R.palmatum?L.是一種傳統(tǒng)的中藥材，中文名稱為“大黃”，它具有悠久的歷史及寶貴的藥用價值。目前，盡管為其開通了人工種植的方法，但是病蟲害的頻繁爆發(fā)和各種疾病的發(fā)生，加上有效藥材含量較低，是威脅其長期生產的主要問題。為了解決以上問題，文章從植物的棲息地土壤出發(fā)，考慮了微生物接種劑對種植土壤的改良作用，同時還考慮了蔗糖改良劑促進植物生長的作用，在此基礎上，根際土壤在兩種聯(lián)合接種劑下的變化及土壤根際微生物群落變化與植物生長變化之間的關聯(lián)也被探明。因此，這項工作不僅在經濟植物中具有廣泛的應用前景，而且強調了可持續(xù)農業(yè)的農業(yè)生態(tài)實踐。

研究方法

實驗設計：

①實驗材料：R.palmatum?L.幼苗，B.?amyloliquefaciens接種劑EZ99，蔗糖

②實驗梯度：EZ99（1.0×10⁵、1.0×10⁶和1.0×10⁷CFU/mL，此處分別用 LB、MB和HB 表示）；

蔗糖（0.15、1.5和15 g/L，分別表示為LS、MS和HS）

③實驗分組：水對照（CK）、僅細菌接種劑（LB、MB、SB）、僅蔗糖（LS、MS、HS）和細菌接種劑+蔗糖組合（ LB + LS、LB + MS、LB + HS、MB + LS、MB + MS、MB + HS、HB + LS、HB + MS和HB + HS）

④田間實驗：設置為RCB（Randomized Complete Block），每個分組含有三個重復區(qū)塊，移植后約1個月，對幼苗（n = 2400）進行根部接種，每株施1L處理土壤，2周后再次施用

實驗方法：

①生長參數(shù)和產量分析：

處理三周后，每月記錄植物高度 (cm)、冠寬 (cm)、葉長 (cm) 和葉寬 (cm) 的變化；

收獲后根系產量參數(shù)：包括主根長（cm）、總根長（cm）、主根直徑（cm）、側根數(shù)、鮮根重（g）、干根重(g)

②土壤理化性質、酶活性和微生物量的測定：

土壤理化：總碳（TC）、總氮（TN）、硝氮（NH₄-N，AN）、氨氮（NO3-N，NN）、總磷（TP）、有效磷（AP）、總鉀（TK）、有效鉀（AK）

土壤酶活性：土壤蔗糖酶（S-SC，EC3.2.1.26）、脲酶（S-UE，EC3.5.1.5）、酸性磷酸酶（S-ACP、EC 3.1.3.2）和堿性磷酸酶（S-AKP ，EC3.1.3.1）

微生物量：微生物生物量碳 (MBC) 作為土壤微生物生物量 (SMB) 的代表

③代謝組學分析：

植物組織樣品的廣靶代謝組研究

④微生物測序：

根際土壤的全長微生物多樣性（16S和ITS）

主要研究結果

1. PGPM和蔗糖應用對R.palmatum?L.生長和產量的影響

R. palmatum?L.在不同生長時期（7、8、9、10月）的生長參數(shù)如圖1所示。與對照組（CK）相比，任意三種濃度的細菌接種劑（LB、MB和HB）處理后的株高、冠寬、葉長和葉寬都有所增加。我們的結果顯示了兩個明顯的倒V形趨勢，在四種含 LB 的處理（LB、LB + LS、LB + MS和LB + HS）中出現(xiàn)了一個外峰。盡管HB處理增加了R. palmatum?L.的生長，但當與蔗糖結合時，它降低了生長，尤其是在 HB + HS 處理下。這表明用高水平蔗糖（15 g/L）修正的高水平細菌接種劑（1.0 ×?10⁷CFU/mL）抑制了PGPM的植物促生長功能。

在收獲時，還確定了地塊產量的變化（圖2）。與兩個明顯的倒V形趨勢的生長結果一致，LB + LS和LB + MS處理下的R. palmatum?L.根的鮮重得到了最顯著的改善（圖2A）。我們進一步分析了主根和側根的變化（圖2B-D），發(fā)現(xiàn)在LB+MS下獲得最大的根長和側根數(shù)，而在LB+LS下獲得最大的主根直徑，這意味著 LB + MS處理刺激側根的數(shù)量和長度，而LB + LS促進主根厚度以提高R. palmatum?L.的根重。

圖2 PGPM和蔗糖在收獲階段對R. palmatum?L.根系的影響

2. PGPM和蔗糖處理下R. palmatum?L.根的代謝差異

重點放在LB+LS的結合分組，通過廣靶代謝組學探索促進植物生長的潛在機制（圖3A）。共對12個新鮮的根樣品進行了表征，鑒定了800種帶注釋的代謝物，主要由38種羧酸及其衍生物、15種有機氧化合物、14種脂肪?；?11種有機氮化合物組成。使用 GC-TOF-MS的全局靶向代謝組分析方法進行相關偏最小二乘判別分析 (PLS-DA)，如圖所示（圖3B），三個生物配對之間的 Spearman相關系數(shù)均超過0.94，這表現(xiàn)了實驗的高重現(xiàn)性。然后通過PLS-DA評分圖來評估這些植物組織樣品之間的差異（圖3C），結果顯示出了分組之間的明顯分離。此外，對潛在結構判別分析（OPLS-DA）建模的監(jiān)督正交投影也揭示了這些分組植物組織樣本代謝組比較中的顯著差異。

通過VIP（Variable Importance in Projection ） ≥ 1、倍數(shù)變化 ≥ 1.5 和 p 值 ≤ 0.05 的篩選標準，顯著鑒定了 38、39、53、47、64 和 49 種差異表達代謝物 (DEMs，Differentially Expressed Metabolites )分別在 CK vs.LS、CK vs.LB、CK vs.LB + LS、LB vs.LB + LS、LS vs.LB + LS 和LS vs.LB（圖4A）。

最多的DEMs是在LS與LB + LS對中，共有26個上調和38個下調。相應的維恩圖說明了所有比較對中獨特和共享的DEMs（圖4B）：顯然，所有六個比較對僅共享一個DEM（N-肉桂酰血清素），這意味著這種代謝物是必不可少的。具體而言，分別在 CK vs.LS、CK vs.LB、CK vs.LB + LS、LB vs.LB + LS、LS vs.LB + LS以及LS vs.LB中分別發(fā)現(xiàn)了30、23、26、24、18和22個DEMs 。

圖3??R. palmatum?L.廣靶代謝組學的評估 (n = 3)

(A)PGPM和蔗糖處理下大黃的外觀(B)R. palmatum?L.代謝譜的相關熱圖(C)偏最小二乘判別分析 (PLS-DA)

為了揭示與蔗糖和PGPM應用相關的全部代謝物，通過熱圖進一步比較了 LS、LB和LB + LS處理與CK的DEMs。如圖4C所示，R.palmatum?L.的主要成分8種蒽醌在三個比較中被差異鑒定。相對于CK，LS組積累了最高水平的大黃素-3-O-硫酸鹽和蘆薈大黃素-1-O-葡萄糖苷，但減少了1-羥基-3-甲基蒽醌水平。LB + LS組積累了最高水平的金黃色素-6-O-葡萄糖苷和托拉克松-8-O-葡萄糖苷，但降低了托拉克松和漆酸D的水平，而LB組僅積累了2-乙酰氧基甲基-蒽醌。對于六種香豆素，它們在處理下都顯示出下調的水平，相比之下，苯丙烷類僅在 LS處理的大黃中發(fā)生變化，3，6-二亞甲基蔗糖上調，阿魏酰酒石酸下調。

同時，通過代謝組鑒定了許多類黃酮，包括黃酮和黃酮醇，在LS或LB 處理下，這些物質在R.palmatum?L.中高度表達，但在LB + LS中的水平下降。另一大類是酚類化合物，其在LB + LS 組中的積累達到高水平，值得注意的是，白藜蘆醇-3-O-硫酸鹽（一種二苯乙烯）在LB處理下高度積累。此外，對于碳水化合物和有機酸，在LS和LB處理下觀察到糖類的整體上調，而在LB + LS處理下有機酸的下調是明顯的。

然后對KEGG中的DEMs進行了代謝富集分析，結果表明醚脂質代謝 (ko00565)、淀粉和蔗糖代謝 (ko00500) 和糖酵解/糖異生 (ko00010) 作為 LS 處理的R.palmatum?L.顯著富集的途徑。嘧啶代謝 (ko00240)、精氨酸和脯氨酸代謝 (ko00330) 和C5分支二元酸代謝 (ko00660) 則是LB處理的R.palmatum?L.顯著富集的途徑。氨基酸生物合成 (ko01230)、2-氧代羧酸代謝 (ko01210) 和精氨酸生物合成 (ko00220) 是LB + LS處理的R.palmatum?L.顯著富集的途徑。

圖4 PGPM和蔗糖處理（n = 3）下對棕櫚樹進行廣靶向代謝組學分析 （A）每次比較中差異表達代謝物 (DEM) 的數(shù)量 （B）維恩圖描繪了所含DEM數(shù)量和重疊DEM的數(shù)量 (C) 樣本中DEM的熱圖分析

3. PGPM和蔗糖處理下的土壤性質、酶活性和微生物量

土壤 pH 值、土壤含水量 (SWC)、土壤有機質 (SOM)、總碳 (TC)、總氮 (TN) ) 和碳氮比(C/N)比相當穩(wěn)定，無論是在根際和大塊土壤中，在銨態(tài)氮 (NH₄-N) 方面也是如此。

然而，與根際土壤相比，大塊土壤中的硝酸鹽氮（NO₃-N）異常高（33.19 ± 2.98 mg/kg），這表明根際微生物對氮的利用率很高。此外，HS根際土壤中有效磷和總磷的量顯著增加，這表明在沒有任何PGPM的情況下添加高蔗糖可能提供了磷轉化所需的碳。LB + LS處理顯著增加了總鉀并降低了速效鉀，這表明根際土壤中鉀的利用率有所提高。普遍增加的碳和營養(yǎng)物質的可用性也將刺激微生物活動，而酶活性水平的提高證實了這一點（圖5）。

LB + HS根際土壤的理化性質與其他處理的土壤沒有顯著差異，然而，添加PGPM和蔗糖后，脲酶(S-UE)酶的活性趨于下降。這些結果表明，LB + LS處理中PGPM和蔗糖的共同作用并沒有導致土壤養(yǎng)分總含量的顯著凈差異，但它們顯著增加了總鉀的含量，這可能調節(jié)了土壤中鉀和養(yǎng)分循環(huán)的生物有效性。

圖5 ?PGPM和蔗糖處理的土壤酶活性（n = 3）和微生物生物量碳（n = 6） 其中：S-SC，蔗糖酶；S-UE，脲酶；S-ACP，酸性磷酸酶；S-AKP，堿性磷酸酶；MBC，微生物生物量碳

?4. PGPM和蔗糖應用對根際微生物群落多樣性和豐富度的影響

生成了基于16S rRNA 基因的細菌測序和基于ITS rRNA 基因的真菌測序圖譜，以更好地揭示大黃根際的微生物群落組成。使用 97%的核苷酸序列同一性，將這些序列分為1685個細菌OTU和492個真菌OTU，其中CK根際細菌OTU豐度最高（1582），其次是LB + LS（1562）、LB（1549）、和LS (1499)處理，而LS根際的真菌OTU數(shù)量(347)最高，其次是CK (325)、LB (314) 和LB + LS (301) 處理(圖6A，B)。維恩圖表明CK、LS、LB和LB + LS處理分別有5、4、17 和 2 個共享的OTU，在細菌群落中共有1263個OTU。在真菌群落中，CK、LS、LB和LB + LS處理分別有16、27、24和31個OTU，共享了150個OTU（圖6A，B）。

PLS-DA分析顯示，四種處理（CK、LS、LB 和 LB + LS）的樣品在細菌群落（分別占總變量的 12.64% 和 8.64%）和真菌群落中均分離良好（分別占總變量的 11.35% 和 8.58%）（圖 6C，D）。對于細菌，處理后的α多樣性雖然與CK相比差異不顯著，但豐富度指數(shù)（Ace和Chao1）和多樣性指數(shù)（Simpson，Shannon，PD Whole Tree除外）在處理中都減少了，特別是在LS土壤中。然而，CK和LB + LS之間的Simpson Index存在顯著差異（p?= 0.0147）。

對于真菌，與CK相比，LS保持較高的豐富度（Ace和Chao1），而LB + LS 和LB的含PGPM處理的任一指數(shù)值都較低。與CK相比，Simpson和Shannon多樣性指數(shù)在所有三種處理下都有所增加，而LB + LS的PD Whole Tree顯著降低（p=0.0808）。因此，添加蔗糖的LS降低了細菌的豐富度和多樣性，而包含PGPM的LB + LS和LB降低了豐富度，但誘導了更多的真菌多樣性。

5. PGPM 和蔗糖應用對根際微生物群落組成的影響

進一步分析微生物群落結構表明，16S rRNA基因序列隸屬于31門257科396屬，而ITS rRNA基因序列隸屬于8門100科170屬。圖7顯示了在群落組成中發(fā)現(xiàn)的15個最豐富的門和目，以及前20個屬。Proteobacteria，Bacteroidetes，Acidobacteria和Planctomycetes是所有樣品中最主要的四種細菌門（圖7A），占所有分類細菌序列相對豐度的67.8-71.68%。Proteobacteria是CK、LS和LB +LS 土壤中的主要細菌門，而Bacteroidetes?(23.4%) 是LB處理土壤中最高的門，其次是Proteobacteria?(20.6%)。這表明PGPM修正后的土壤細菌群落與蔗糖處理 (LS) 或 CK 后的土壤細菌群落顯著不同。此外，LB和LB + LS處理的樣品中Cyanobacteria的相對豐度增加，而CK和LS樣品中的Rokubacteria增加。

在目水平上，Chitinophagales含量最高，uncultured_bacterium_c_Subgroup_6、Tepidisphaerales、Cytophagales、Betaproteobacteriales和Sphingomonadales緊隨其后，它們是所有樣品中土壤中存在的六種最主要的細菌。在這六個目中，與CK和LS相比，LB處理的土壤中的?Cytophagales和Saccharimonadales含量最高。這兩種處理的土壤不僅在目水平上而且在屬水平上都含有相似的細菌組成。特別是，LB 處理和PGPM施用于土壤時，uncultured_bacterium_c_Subgroup_6的相對豐度降低，而uncultured_bacterium_o_ Saccharimonadales的相對豐度增加?？傊?，我們的結果表明，添加蔗糖對LS土壤中的細菌群落結構影響不大，但它調節(jié)了LB + LS土壤中添加 PGPM 誘導的多樣性。

圖7 在蔗糖和PGPM處理下，門、目和屬的分類水平上，根際土壤中細菌 (A) 和真菌 (B) 群落的相對豐度

在分類的真菌群落中（圖7B），Ascomycota和Mortierellomycota是兩個最豐富的門，合計占總真菌序列相對豐度的92.5% 以上。最豐富的Ascomycota在CK (79.1%) 處理中富集最多，在 LB + LS (71.6%) 處理中減少最多。相比之下，在 LB + LS 處理下，通常排名第二的Mortierellomycota的豐度更高。此外，第三豐富的Basidiomycota似乎對添加蔗糖很敏感。有趣的是，Chytridiomycota的相對豐度在LS和LB處理中降低。在目水平上，Hypocreales最為豐富，接下來依次是Mortierellales、Sordariales、Pezizales、Glomerellales、Chaetothyriales?和?Pleosporales，它們是最主要的七種真菌。與CK相比，Hypocreales在所有處理中均下降。值得注意的是，盡管在LS和LB處理的土壤中Pezizales增加，但其豐度出乎意料地在LB + LS處理下最低。在屬水平上，與CK相比，所有處理的第一優(yōu)勢屬Fusarium減少，而第二優(yōu)勢屬Mortierella增加，其中LB+LS處理的增幅最大。簡而言之，與細菌群落不同，真菌群落結構在 CK 與三種處理之間甚至在不同處理之間均發(fā)生了明顯變化。

6. 土壤理化性質對微生物豐度的影響

根據(jù)選定的土壤理化性質和門和物種水平的前10種微生物豐度進行了RDA分析（圖 8）。結果表明，共可以解釋細菌總變異的42.11%（門）和31.85%（種），可以解釋真菌總變異的62.68%（門）和26.85%（種）。

門水平上，總細菌群落的結構與某些土壤理化性質密切相關：TC、TK、PH和NH₄-N（圖8A）。LS土壤以Proteobacteria、Gemmatimonadetes和Planctomycetes為主，與TC和NH₄-N最相關，LB處理的土壤以Bacteroidetes、Patescibacteri和Verrucomicrobia為主，這些與TK和pH最相關，而 LB + LS 土壤以Verrucomicrobia、Chloroflexi和Acidobacteria為主，它們都與土壤TK和NH₄-N 相關。因此，土壤理化性質與優(yōu)勢菌種的相對豐度之間的關系表明，pH、TC、NO₃-N 和TK是影響環(huán)境因素（圖8C）。RDA結果還表明Nitrospira和Pontibacter的相對豐度與TK含量相關，但與LB處理的土壤中的TC呈負相關。Flavisolibacter和Pontibacter的相對豐度均與 LB + LS土壤中的pH值相關，而Sphingomonas的相對豐度與 AK和TC相關。

圖8 蔗糖和PGPM處理下門（A,B）和種（C,D）水平的RDA圖

對于門水平的真菌，總群落組成與以下土壤理化性質密切相關：TK、NH₄-N、TC、pH和TP（圖8B）。LS土壤以Rozellomycota和Mortierellomycota為主，其成員與TK和TP相關性最高，LB處理的土壤以Mortierellomycota、Zoopagomycota和Mucoromycota為主，與 TP、TN和SOM相關性最高，以及LB + LS土壤以Basidiomycota和Chytridiomycota為主，它們與土壤pH和C/N有關。

土壤理化性質與種水平優(yōu)勢真菌相對豐度之間的關系表明，影響群落的主要環(huán)境因素是TP、TN、AP、AK、TC和NO₃-N（圖8D）。RDA結果還表明，在 CK和LB處理的土壤中，Fusarium_equiseti豐度與TK和NO₃-N含量相關，Fusarium_domesticum和Humicola_nigrescens的相對豐度與LS處理下的NO₃-N 含量相關，對于Paraphoma_rhaphiolepidis、Botryotrichum_domesticum和?Mortierella_rishikesha，它們的相對豐度與 LB + LS 土壤中的SOM和pH值相關。

7. PGPM和蔗糖應用對根際微生物群落功能的網絡分析及影響

對最豐富的屬之間的Spearman相關系數(shù)進行網絡分析（圖9），顯示出50個主要細菌和真菌屬之間的相關性。

其中，對于細菌的屬水平而言，uncultured_bacterium_o_Actinomarinales和?uncultured_bacterium_o_Subgroup_7?是最正相關的屬（rs = 0.42），而在真菌群落網絡中，最正相關的屬是Chaetomium和Tetracladium（rs = 0.42）。

圖9 基于相關性的細菌(A)和真菌(B)群落網絡分析

基于16S rRNA基因土壤細菌組成數(shù)據(jù)，使用COG功能分類來預測功能分布和豐度。與CK土壤相比，我們發(fā)現(xiàn) LS、LB 和 LB + LS 處理分別富集了18、23和17個途徑。在這些比較中，LS土壤樣品中的氨基酸轉運和代謝、翻譯、核糖體結構和生物發(fā)生、細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生以及無機離子轉運和代謝顯著富集。在LB處理下，輔酶轉運與代謝、信號轉導機制、核苷酸轉運與代謝均顯著富集。最后，LB + LS樣品中的碳水化合物轉運和代謝、復制、重組、無機離子轉運和代謝、翻譯后修飾、蛋白質周轉和分子伴侶均顯著富集。

總?結

（1）共同施用蔗糖和細菌接種劑的新方法能夠顯著提高R.palmatum?L.的數(shù)量和質量，并刺激根際啟動；

（2）代謝組查明了施加影響后根際土壤和微生物代謝后差異，指明了影響植物生長的潛在路徑；

（3）通過全長微生物多樣性的分析發(fā)現(xiàn)微生物特征與植物生長有著密切聯(lián)系；

（4）將環(huán)境因子與代謝組和微生物多樣性聯(lián)合分析，揭露了影響植物生長的因素。

 

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