人類下丘腦發(fā)育時空圖譜已被成功破譯！

 

研究背景

下丘腦在調節(jié)機體基本穩(wěn)態(tài)和行為方面具有關鍵作用，包括進食、日常節(jié)律、繁殖、壓力反應等。下丘腦神經元多樣化的特點是經典神經遞質（氨基丁酸?[GABA]、谷氨酸、乙酰膽堿、多巴胺或組胺）和不同神經肽或激素的聯(lián)合表達，這是構成下丘腦功能復雜性的基本因素。神經元亞群的發(fā)育異常會誘發(fā)下丘腦功能障礙相關疾病，如肥胖、能量失衡和睡眠障礙。對嚙齒動物的研究揭示了胎兒和成人下丘腦在細胞和分子水平上的特性，并提供了對下丘腦復雜細胞層次和功能的詳細了解。然而，關于人類下丘腦膠質細胞和神經元發(fā)育的時空分子特征知之甚少。

研究材料

材料：人類下丘腦的采樣時間范圍從妊娠周（GW）7到20（具體為GW7、GW8、GW10、GW12、GW15、GW18、GW20），其中GW12和GW18分別兩個生物學重復；GW15到GW20（GW15、GW18_1、GW20），沿前后軸大致分為三組，大致對應于前、結節(jié)/內側和后域

方法：單細胞轉錄組測序、免疫熒光

研究成果

1、人類下丘腦發(fā)育的分子多樣性

本研究利用scRNA-seq檢測了112,376個人類下丘腦細胞，分別為GW7-20（圖?1A）。聚類分析確定了主要細胞群（圖?1B），通過marker基因來鑒定已知細胞類型，包括神經上皮細胞（NE）、NP、神經元、星形膠質細胞、OL前體細胞（OPC）、OL譜系細胞、小膠質細胞等（圖?1C，1D）?；诩毎愋秃头肿庸δ埽瑢⑾虑鹉X發(fā)育的進程分為四個階段：GW7、GW8-10、GW12-15和GW18-20（圖?1E，1F）。通過免疫熒光也觀察到GW15下丘腦后部區(qū)域的神經膠質細胞比例低于前部/內側區(qū)域（圖?1G，1H），表明膠質細胞的在不同空間區(qū)域的發(fā)育是不同步的。

2、早期下丘腦NE和祖細胞的異質性

根據(jù)細胞群間的差異基因確定細胞類型，包括NE、NP、神經元和一些間充質腦膜樣成纖維細胞（圖?2A）。免疫染色顯示了GW8中不同類型細胞的基因表達和位置（圖?2B，2C），同時發(fā)現(xiàn)LUM、COL3A1和FOXC1在腦膜細胞中高度表達（圖?2D）。排除腦膜樣成纖維細胞簇，構建了GW7其余細胞的發(fā)育軌跡（19,916?個細胞；圖?2E），發(fā)現(xiàn)從NE到NP的細胞發(fā)育譜系，通過對DEG的GO分析，確定了從NE到早期祖細胞（圖?2F）譜系轉變的關鍵信號通路。此外，還展示了從NE到NP關鍵TF的表達模式（圖?2G）。通過亞群分析，確定了7個NE亞型和8個NP亞型（圖?2H）。此外，評估了早期NE和NP亞群之間的潛在關系（圖?2I，2H）。這些結果表明，不同下丘腦位置的早期NPs顯示出分子異質性。

3、由調節(jié)基因控制的不同祖細胞分化命運

NP被進一步細分為25種細胞類型（圖?3A），使用SCENIC算法進行了“調節(jié)子”分析，發(fā)現(xiàn)膠質細胞譜系富含參與神經膠質的多個已知調節(jié)子，包括OLIG1/2、SOX8和幾個早期基因相關的調節(jié)子（圖?3B，3C）以調節(jié)細胞周期進程。基于基因網(wǎng)絡和富集分析（圖?3D，3E），發(fā)現(xiàn)在結節(jié)NP亞型中表達的OTP和PRDM12調節(jié)子可以調節(jié)不同的ARC神經元命運，這與它們在控制ARC分化中的作用一致。這些數(shù)據(jù)表明，NPs的細胞命運確定發(fā)生在下丘腦發(fā)育的早期階段，并且細胞分化由多個關鍵TF的組合決定。

4、下丘腦神經元的時空組成

將神經元（n=32,811個細胞）細分為50個簇，包括GABA能、谷氨酸能和組胺能（HDC）神經元（圖?4A）。幾種亞型的空間特征由其特定神經肽的表達明確定義（圖?4B）。通過對幾個代表性核的相關分布研究，發(fā)現(xiàn)前/結節(jié)區(qū)域的核生成出現(xiàn)在早期（GW7-8），而后部區(qū)域的核生成發(fā)生在GW10之后（圖?4C）。表明人類下丘腦中的不同細胞核是在不同的時間窗中形成的，遵循前后和內外空間排序。

5、ARC神經元亞群的不同譜系軌跡

本研究共收集3,628個ARC，確定了六種ARC亞型，包括KISS1+TAC3+、GHRH+GSX1+、SST+PCP4+、AGRP+NPY+、POMC+CBLN1+和POMC+TBX3+簇（圖?4B）。通過整合和預測分析確定了有助于ARC形成的NP，從NP1、NP2和NP17中提取了與ARC相關的祖細胞，并在ARC中繪制了這些祖細胞和神經元亞型，以使用velocyto進行擬時序分析（圖?4D），發(fā)現(xiàn)人類ARC中的神經元亞群在轉錄上出現(xiàn)在不同的時間點（圖?4E）。利用免疫染色來驗證神經元亞型marker的表達，觀察到POMC表達，并且KISS1+細胞顯著存在于外側ARC中，但在GW17僅觀察到少數(shù)表達NPY的細胞（圖?4F）。這些結果揭示了ARC神經元亞群的分子多樣性，并且它們發(fā)育的時間不同。

6、OL的分子表達異質性

本研究確定了EGFR+?pre-OPC、PDGFRA+?OPC（OPCs）和OL（BCAS1+?和?MBP+）（圖?5A），然后將OPC分為四個亞型，OL分為六個亞型（圖?5B）。使用velocyto對OPC和未成熟OL亞群進行軌跡分析，確定了人類下丘腦OL譜系的不同分化路徑（圖?5C）。根據(jù)不同妊娠期OL譜系亞群的比例，發(fā)現(xiàn)從OPC2到OL1和從OPC1到OL2的兩條OL早期路徑分別代表GW12和GW18/20的峰值（圖?5D）。對人類下丘腦中的PDGFRA、MBP和OLIG2進行免疫染色，發(fā)現(xiàn)PDGFRA+?OPCs少量存在于GW10地幔區(qū)，并從GW12到GW17逐漸增加（圖?5E）。對EGFR、PDGFRA和MBP進行了免疫染色，分別在三個時間階段（GW12、GW14、GW17）的前部、內側和后部區(qū)域顯示preOPCs、OPCs和OLs特征。這些OL譜系細胞在人類下丘腦發(fā)育中沿前后軸顯示出空間發(fā)育不同步性（圖?5F-5J）。Cell?Chat細胞通訊分析，確定了早期特異性信號，包括WNT、Hippo和相關的粘附分子，如整合膜蛋白通路（圖?5K和5L），明確了它們在GW12的早期膠質生成過程中介導膠質-神經元相互作用。

7、哺乳動物下丘腦膠質細胞的不同轉錄模式

對3,500個高度可變的基因進行scCoGAPS分析，發(fā)現(xiàn)了137個富集模式，主要的人類下丘腦細胞類型被映射到小鼠RNA-seq數(shù)據(jù)集中（圖?6A），發(fā)現(xiàn)大量人類特異性基因在下丘腦的主要細胞類型中特異性富集（圖?6B）。接下來，關注富含神經元的高表達人類特異性基因，并進一步明確這些基因在不同神經元亞型中的表達（圖?6C）。DIRAS3在ARC的NPY+神經元中表現(xiàn)出特異性表達，并在GW15后逐漸增加，這與NPY的時間表達模式相似（圖?6E）。
與小鼠相比，神經膠質細胞顯示出人類基因表達模式（圖6F），這種模式中的marker基因已在人類下丘腦的早期OPCs或OLs中特異性表達（圖?6G）。通過人類OL和神經元細胞的互作分析，發(fā)現(xiàn)人類模式107中的子集基因參與早期OL-神經元通信（圖?6H）。人類星形膠質細胞的發(fā)育從GW15開始，但在小鼠出生后2天開始（P2）（圖?6I），證明下丘腦星形膠質細胞形成的物種差異。為進一步驗證，在人類（GW17）和小鼠（P2）下丘腦中對HOPX和GFAP進行了聯(lián)合染色，結果發(fā)現(xiàn)HOPX+GFAP+星形膠質細胞亞型主要存在于人類中（圖?6K），表明不同星形膠質細胞亞型具有物種特異性。

研究結論

本研究分析了下丘腦主要細胞類型及其差異表達基因，還確定了編碼NP的重要調節(jié)因子。此外，也定義了在下丘腦神經發(fā)生過程中占據(jù)特定細胞核的不同神經元亞群的時空轉錄模式。并與小鼠OLs相比，確定了人類OLs相關的基因表達模式。此外，早期OL神經元相互作用可能通過多種信號通路影響神經元分化。綜上，本研究以單細胞分辨率提供了人類下丘腦發(fā)育中神經元和神經膠質細胞的全面分子圖譜，并闡明了人類下丘腦的時空組織和下丘腦核形成的關鍵調節(jié)因子。

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