一文讀懂全基因組甲基化測(cè)序技術(shù)原理及應(yīng)用

 

技術(shù)背景

DNA甲基化是一種在原核和真核生物基因組中常見(jiàn)的復(fù)制后表觀遺傳修飾，可以在不改變 DNA分子一級(jí)結(jié)構(gòu)的情況下調(diào)節(jié)基因組的功能，其在基因表達(dá)、轉(zhuǎn)座子沉默、染色質(zhì)相互作用、細(xì)胞分化以及生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。

其形成過(guò)程主要是在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將S-腺苷甲硫氨酸分子上的甲基(CH3-)轉(zhuǎn)移到DNA的CpG兩個(gè)核苷酸的胞嘧啶上進(jìn)行DNA 甲基化修飾，形成 5-甲基胞嘧啶 (5-mC)、N6-甲基腺嘌呤 (N6-mA) 以及7-甲基鳥(niǎo)嘌呤(7-mG)。

DNA 甲基化造成基因沉默的原因大多都是由于轉(zhuǎn)錄受到抑制從而影響了目的基因的表達(dá)：（1）啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生甲基化 ；（2）基因序列中某位點(diǎn)發(fā)生甲基化抑制蛋白的表達(dá) ；（3）染色體結(jié)構(gòu)由于受到 DNA 序列的變化從而變得緊密。

因此，闡明DNA甲基化的動(dòng)力學(xué)和遺傳學(xué)及其分子調(diào)控機(jī)制，可在基因表達(dá)層面上探究動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆性機(jī)理，為優(yōu)良新品種的培育和遺傳改良研究提供更多理論依據(jù)。

目前應(yīng)用廣泛的全基因組甲基化檢測(cè)方式主要是BS-seq：用亞硫酸氫鹽處理DNA將胞嘧啶殘基（C）轉(zhuǎn)化為尿嘧啶（U），而5-甲基胞嘧啶殘基（5mC）不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)變。因此可通過(guò)測(cè)序的手段識(shí)別甲基化位點(diǎn)。但是亞硫酸氫鹽處理后DNA會(huì)發(fā)生降解，測(cè)序長(zhǎng)度受限，使得較大的區(qū)域難易被解析。

三代測(cè)序平臺(tái)則可以在不依賴DNA實(shí)驗(yàn)處理的情況下，根據(jù)信號(hào)差來(lái)識(shí)別甲基化位點(diǎn)信息。其中，PacBio 已經(jīng)實(shí)現(xiàn)通過(guò)HiFi測(cè)序直接檢測(cè) DNA 樣本中 CpG 位點(diǎn)的 5mC甲基化。基于HiFi 的 5mC 檢測(cè)能夠在提供既長(zhǎng)又準(zhǔn)的測(cè)序結(jié)果的同時(shí)，給出準(zhǔn)確的單倍型甲基化信息。同時(shí)，具有甲基化信息的HiFi數(shù)據(jù)，所占存儲(chǔ)僅增~5%，極大的壓縮了可分析的空間，為表觀遺傳挖掘保駕護(hù)航！

技術(shù)原理

PacBio平臺(tái)主要通過(guò)DNA聚合酶與模板鏈結(jié)合，在鏈合成的過(guò)程中，不同熒光標(biāo)記的堿基會(huì)釋放不同的熒光信號(hào)，根據(jù)光的波長(zhǎng)與峰值從而判斷堿基類型與順序。聚合酶合成中每個(gè)堿基間都存在時(shí)間間隔，當(dāng)模板堿基有修飾時(shí)，兩個(gè)相鄰的脈沖峰之間的距離就會(huì)延長(zhǎng)。當(dāng)IPD比例（兩個(gè)相鄰的脈沖峰之間的距離和參考序列距離的比值）明顯大于1 時(shí)，可推斷這個(gè)位置存在修飾。

技術(shù)優(yōu)勢(shì)

 

分析方案

測(cè)序深度；≥10x。根據(jù)數(shù)據(jù)檢測(cè)圖可以看到，當(dāng)深度達(dá)到10X，即可達(dá)到很好的檢出效果。

應(yīng)用場(chǎng)景

（1）全基因組甲基化

對(duì)單個(gè)樣本進(jìn)行HiFi測(cè)序可檢測(cè)整個(gè)基因組的甲基化模式，如轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的低甲基化。不同組織部位甲基化差異，構(gòu)建全基因組的甲基化圖譜。

（2）泛基因組甲基化

通過(guò)對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行測(cè)序來(lái)確定物種品系間的差異甲基化，從而揭示品系間功能差異的調(diào)控機(jī)制。

本研究構(gòu)建了青鳉（Oryzias latipes）近親繁殖系中12尾材料的基因組，并通過(guò)比對(duì)構(gòu)建了青鳉的圖型泛基因組。結(jié)果顯示泛基因組總長(zhǎng)度為1.3 Gb，大約是其參考基因組的1.8倍。通過(guò)泛基因組展示了更大、更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變異-“暗變異”，為進(jìn)一步研究結(jié)構(gòu)變異（SV）如何影響感興趣的表型提供了重要的研究基礎(chǔ)。作者通過(guò)構(gòu)建基因組時(shí)的三代測(cè)序數(shù)據(jù)，進(jìn)一步對(duì)12尾近親繁殖系的大腦樣本中的CpG甲基化進(jìn)行了差異研究。結(jié)果顯示，甲基化模式在多代中表現(xiàn)一致，說(shuō)明甲基化是青鳉魚(yú)的一種遺傳性狀，能夠持續(xù)多代，并可能影響表型性狀。最后結(jié)合RNA等數(shù)據(jù)，表明galm基因甲基化可能性與肝臟表達(dá)之間存在顯著相關(guān)性。

（3）單體型甲基化

HiFi測(cè)序能夠同時(shí)分階段讀取母系和父系單倍型，并檢測(cè)甲基化。這直接揭示了印記的模式，其中染色體的甲基化狀態(tài)取決于它是從母親還是父親遺傳的。

日本田中魚(yú)（Oryzias latipes）作為脊椎動(dòng)物模式生物有著悠久的歷史。我們利用其異常高的近親繁殖耐受性建立了Medaka近親繁殖Kiyosu Karlsruhe（MIKK）小組：來(lái)自單個(gè)野生種群的近等基因脊椎動(dòng)物系的集合[3]。

在與這篇文章一起發(fā)表的配套文章中，我們根據(jù)Illumina短讀序列與最近、完全組裝的參考基因組（日本南部medaka自交系HdrR）的比對(duì)，提供了80個(gè)個(gè)體MIKK面板系[4]的詳細(xì)遺傳特征。

盡管這使我們能夠發(fā)現(xiàn)與HdrR相關(guān)的MIKK面板中的許多遺傳變異，但該方法不可避免地隱藏了某些變異，包括更大、更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)變異-“暗變異”-這可能會(huì)對(duì)每個(gè)品系產(chǎn)生功能性后果。在這里，我們描述了我們?nèi)绾问褂门＝蚣{米孔技術(shù)（ONT）長(zhǎng)讀測(cè)序來(lái)揭示12個(gè)MIKK面板系中的一些暗變異，從而使我們對(duì)其基因組變異進(jìn)行更完整的評(píng)估，并為進(jìn)一步研究結(jié)構(gòu)變異（SV）如何影響感興趣的表型鋪平了道路。

 

DNA甲基化分析：

• MIKK面板樣本中所有顯著CpG島差異甲基化的熱圖。
• CpG島按基因組位置和X軸排序。樣本通過(guò)Y軸上的分層聚類排序，并進(jìn)行顏色編碼，以便用相同的顏色表示兄弟線。
• 顏色方案根據(jù)來(lái)自的中值對(duì)數(shù)似然比的值?3（藍(lán)色）到3（紅色）之間的值不明確?1和1為白色。
• B紅色顯著差異甲基化CpG（n=4249）和藍(lán)色所有非顯著島（n=8727）的最接近基因TSS的距離分布。
• C 24條HdrR染色體基因組窗口中顯著CpG島的數(shù)量，從0（白色）到6（深紅色）。
• D示例100kb區(qū)域包含紅色的顯著CpG島（chr15:1565040-1565987），而非白色的非顯著CpG島。
• E面板D中突出顯示的CpG島的CpG水平對(duì)數(shù)似然比核密度圖。通過(guò)降低中值llr，在Y軸上對(duì)樣本進(jìn)行排序。單個(gè)CpG值由點(diǎn)表示。
• 圖D中突出顯示的CpG島的對(duì)數(shù)似然比熱圖，按樣本分層聚類。X軸上是按基因組位置排序的單個(gè)CpG

 

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