甘薯鐮刀菌根莖腐爛病病原菌基因組序列發(fā)布！

近日， Microbiology Spectrum（IF 9.0431）在線發(fā)表了廣東省農(nóng)科院作物所黃立飛副研究員、房伯平研究員為通訊作者的研究論文 “Whole-Genome Sequencing and Comparative Genome Analysis of?Fusarium solani-melongenae?Causing Fusarium Root and Stem Rot in Sweetpotatoes”，該研究報(bào)道了F. solani-melongenae?分離株 CRI 24-3 的全基因組組裝序列，并且深入探討其功能基因信息，為其他密切相關(guān)的鐮刀菌屬物種的基因組研究提供基礎(chǔ)，通過比較基因組分析促進(jìn)了對鐮刀菌基因組特征和進(jìn)化關(guān)系的整體理解。百邁客有幸參與此項(xiàng)研究工作，對該真菌全基因組進(jìn)行測序組裝注釋和比較基因組分析。

摘要

甘薯（Ipomoea batatas）是全球第八大重要作物，然而，甘薯的生產(chǎn)和質(zhì)量受到世界各地流行的鐮刀菌病害的威脅。在這項(xiàng)研究中，研究了一種導(dǎo)致甘薯根和莖腐爛的鐮刀菌。使用二代和三代高通量測序技術(shù)分離和測序病原真菌 CRI 24-3，獲得包含 15,374 個(gè)預(yù)測編碼基因的 49.6 Mb 基因組。分子系統(tǒng)發(fā)育分析表明，CRI 24-3 是?F. solani-melongenae?菌株，位于?F. solani?物種復(fù)合體 (FSSC) 的進(jìn)化枝 3 內(nèi)。與其他測序 FSSC 中鑒定的毒力因子數(shù)量相比，CRI 24-3 顯示出相對較高數(shù)量的毒力因子，例如碳水化合物活性酶 (CAZymes)、病原體-宿主相互作用 (PHI) 蛋白和萜烯合酶 (TSs)成員。比較基因組分析揭示了 CRI 24-3 與其他 FSSC 物種之間相當(dāng)大的保守性和獨(dú)特性?？傊狙芯康慕Y(jié)果提供了有關(guān)甘薯鐮刀菌的重要遺傳信息，有助于探索致病機(jī)制和制定鐮刀菌病管理策略。

結(jié)? 果

真菌分離和形態(tài)學(xué)分析表明CRI 24-3是FRST的病原菌

田間分析表明，水浸病斑最初出現(xiàn)在FRST感染甘薯的基部莖上（圖1A）。此外，在潮濕或多雨的天氣中，觀察到大量的紅色外皮覆蓋在壞死的基部莖上（圖1B）。隨著病害蔓延，上部莖葉逐漸褪綠和枯萎。貯藏根呈凹形病斑，環(huán)狀邊緣清晰，白色菌絲分布在凹陷病斑上，塊莖內(nèi)部有破裂的壞死組織（圖1C和D），從而顯著降低甘薯的產(chǎn)量和質(zhì)量。從患病甘薯樣品中分離出優(yōu)勢真菌菌落 CRI 24-3。然后根據(jù) Koch 的假設(shè)進(jìn)行 CRI 24-3 的致病性測試。切片的根部觀察到超過接種點(diǎn)的水褐色病斑，菌絲稀疏，陰性對照不存在（圖1C），表明CRI 24-3是甘薯FRST的致病因子。

CRI 24-3 在馬鈴薯蔗糖瓊脂 (PSA) 和合成低營養(yǎng)瓊脂 (SNA) 上培養(yǎng)，用于進(jìn)一步的形態(tài)學(xué)分析。在培養(yǎng)箱（25°C、12 小時(shí)光周期和 75% 相對濕度）中培養(yǎng) 4 天后，PDA 上的平均菌落直徑為 4.4 cm。蓬松的菌落有分隔的氣生菌絲體，散布在盤子上。菌落表面呈乳白色，背面呈黃色（圖2A至C）。小分生孢子豐富，呈橢圓形至腎形，大多數(shù)為 1 隔（圖 2E）。1 隔小分生孢子為 (7.8 至 13.8) × (2.1 至 3.9) μm。大分生孢子呈鐮刀形，3-5 縱隔，頂端細(xì)胞稍彎曲，基底細(xì)胞呈足狀（圖2F）。3 至 5 隔大分生孢子的平均寬度為 4.1 至 4.9 μm。來自短側(cè)枝的末端或閏厚厚孢子（6.1至7.4μm）是球形和粗糙的（圖2H）。4周后，菌落被點(diǎn)狀暗紅色外皮覆蓋，類似于田間受感染的甘薯（圖1B和2I）。CRI 24-3 的梨形外皮層具有乳頭狀頸部和小孔（圖 2J），子囊孢子通過小孔釋放。此外，棒狀子囊含有 8 個(gè)單列 1 隔子囊孢子，大小為（10.7 至 12.6）×（3.9 至 5.0）μm（圖 2K和L）。相比之下，SNA 上的菌落生長較弱（圖 S1），底物菌絲稀疏，4 天后平均直徑為 4.1 厘米。SNA上CRI 24-3分生孢子和周殼的數(shù)量相對于PSA上的較少。然而，分生孢子和外皮的形態(tài)特征與在 PDA 上觀察到的相似。分離株CRI 24-3（登錄號ACCC 39784）的代表性培養(yǎng)物保藏在中國農(nóng)業(yè)培養(yǎng)物保藏中心。

生成并注釋了 CRI 24-3 的高質(zhì)量基因組組裝草圖

經(jīng)數(shù)據(jù)質(zhì)控后共獲得 452,011 條高質(zhì)量的clean reads（平均長度 13,525.1 bp）（表 S1）。CRI 24-3的 49.6 Mb 基因組是由 12 個(gè)contigs產(chǎn)生的，該基因組具有 4.5 Mb 的contigs N50 和 50.7% 的 GC 含量，覆蓋深度估計(jì)為 123.3 倍（圖 3；表 1）?；蚪M質(zhì)量評估結(jié)果表明，CRI 24-3 的基因組組裝完整且準(zhǔn)確，因?yàn)?CRI 24-3 中的單拷貝直系同源基因與 sordariomycetes_odb10 數(shù)據(jù)集中所有 3,817 個(gè)完整核心基因的 99.9% 匹配（表 1）。

使用三種基因結(jié)構(gòu)預(yù)測方法，共鑒定了 15,374 個(gè)平均基因長度為 2.0 kb 的預(yù)測基因（圖 S2A；表 1）。此外，基于序列相似性比較，通過多個(gè)功能數(shù)據(jù)庫注釋了 15,256 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因（表 2）?；诜侨哂嗟鞍踪|(zhì)序列 (Nr) 數(shù)據(jù)庫分析（圖 S2B），CRI 24-3 中約 80.3% 的蛋白質(zhì)編碼基因與F. vanettenii?77-13-4 的基因組匹配，這表明這兩個(gè)物種密切相關(guān)。此外，對 10,655 個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行了基因本體論 (GO) 分析（表 2) 并在功能上分為三類：“細(xì)胞成分”(7,100)、“分子功能”(8,279) 和“生物過程”(8,069)。使用真核直系同源群 (KOG) 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行的進(jìn)一步功能分析表明，“僅一般功能預(yù)測”類別 (R, 22.2%) 的蛋白質(zhì)數(shù)量多，其次是“次級代謝物生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝”類別（Q，8.4%）和“能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換”類別（C，7.8%）（圖 3）。此外，使用京都基因和基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫對 3,925 個(gè)編碼基因的分析表明，2,329 個(gè)基因富集在屬于五個(gè)類別的 114 個(gè)代謝途徑中（圖 S4；表 2）。大多數(shù)基因富含碳水化合物（471）和氨基酸代謝（435）途徑。

基于分子系統(tǒng)發(fā)育分析，CRI 24-3 被鑒定為F. solani-melongenae

使用 BLASTn 工具與 NCBI 數(shù)據(jù)庫的比對表明，從 CRI 24-3 基因組 DNA 擴(kuò)增的 ITS 序列 PCR 與F. solani-melongenae?NRRL 22101 具有 99.8% 的同一性，具有 100% 的查詢覆蓋率（未發(fā)表的數(shù)據(jù)），表明 CRI 24-3 是 FSSC 的成員。為了更準(zhǔn)確地識別 CRI 24-3，進(jìn)行了基于ITS、RPB2和TEF 1-α的串聯(lián)序列的信息系統(tǒng)發(fā)育分析（圖 4A）。組合序列樹中的大多數(shù)引導(dǎo)值高于 ITS 樹（未發(fā)布數(shù)據(jù)）中的值。三基因座樹顯示了一個(gè)優(yōu)勢分支，包括 FSSC 進(jìn)化枝 3 內(nèi)的 38 個(gè)群內(nèi)末端，F(xiàn)SSC 進(jìn)化枝 1 和 2 內(nèi)的分類群形成了一個(gè)基礎(chǔ)姊妹群（圖 4A和表 S2）。由 FSSC 分類群形成的主要分支被分成一個(gè)末端節(jié)點(diǎn)，包括 CRI 24-3 和另一個(gè)包含F. protoensiforme?(FSSC 32) 和F. riograndense的亞基底節(jié)點(diǎn)。重要的是，CRI 24-3 與F. solani-melongenae密切相關(guān)，并聚集在 FSSC 進(jìn)化枝 3 中。因此，F(xiàn)RST 的分離株 CRI 24-3 被鑒定為F. solani-melongenae?(FSSC 21) ，此方法是基于 Nilsson 等人提出的方法。

探索了 CRI 24-3 和 15 個(gè)基因組測序的 FSSC 物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（表 S3）。F. illudens?NRRL 22090 被用作外群以生成有根的系統(tǒng)發(fā)育樹。來自 16 個(gè)鐮刀菌基因組共享的 1,544 個(gè)單拷貝同源基因的全基因組系統(tǒng)譜得到了很好的支持，其中 14 個(gè)節(jié)點(diǎn)具有 100% 的引導(dǎo)值（圖 4B）。16 個(gè) FSSC 物種分為三個(gè)已知的進(jìn)化枝。系統(tǒng)基因組關(guān)系分析顯示 CRI 24-3 與F. falciforme?(FSSC 3 + 4)密切相關(guān)，具有 100% 引導(dǎo)支持。這兩個(gè)物種與F. vanettenii、F. solani和F. metavorans形成了一個(gè)單系群。，表明這些物種可能共享一個(gè)祖先。

在 CRI 24-3 中發(fā)現(xiàn)了豐富的毒力因子，包括獨(dú)特的單孢二烯合酶

在這項(xiàng)研究中，在 CRI 24-3 中鑒定了 889 個(gè)推定的 CAZymes 編碼基因（表 S4），這可能與前面描述的突出的碳水化合物代謝途徑有關(guān)（圖 3；圖 S4）。CRI 24-3 中 CAZymes 的數(shù)量相對于其他一些鐮刀菌更高（例如， FSSC 進(jìn)化枝 2 內(nèi)的F. virguliforme中的 629 個(gè)；FSSC 進(jìn)化枝 3 內(nèi)的F. neocosmosporiellum?中的551個(gè)；在來自?F. sambucinum?物種復(fù)合體的禾谷鐮刀菌中的481個(gè)）。CAZymes 根據(jù)它們的家族分布和基因數(shù)不同（圖 5A ）分為六類，糖苷水解酶 (GHs, 379) 是大的一類，其次是碳水化合物酯酶 (CEs, 199) 和輔助活性 (AAs, 136)。CRI 24-3 有 60 個(gè) GH 家族，其中大多數(shù)酶分布在 GH3 (37)、GH43 (35)、GH109 (35) 中，而一些常見的 GH 亞家族，如 GH29、GH30 和 GH44，在 CRI 24-3中不存在(圖 5B )，類似于F. virguliforme?中的 CAZyme 曲線。在 CRI 24-3 中鑒定了來自 GH11 的三種假設(shè)的 β-1,4-木聚糖酶，稱為 FsmGH11.1、FsmGH11.2 和 FsmGH11.3（表 S4）。多重比對（圖S5）顯示FsmGH11.3與NhGH11（GenBank登錄號XP_003050975.1 ）具有高的序列相似性（44.1％），NhGH11是來自F. vanettenii?GH11的β-1,4-木聚糖酶被證明可以分解各種木聚糖底物，這暗示 FsmGH11.3 和 NhGH11 可能具有相似的木聚糖酶水解能力。

比較基因組分析揭示了 CRI 24-3 和其他 FSSC 物種的基因組保守性和獨(dú)特性

比較來自 18 個(gè)鐮刀菌屬物種的基因組，包括 16 個(gè)已測序的 FSSC 物種、F. fujikuroi和F. oxysporum，以進(jìn)一步探索基因組多樣性和進(jìn)化關(guān)系（表 3；表 S3）。通過基因家族結(jié)構(gòu)分析，共鑒定和注釋了包含 279,680 個(gè)基因的 16,130 個(gè)家族（GF1 至 GF16,130）。結(jié)果表明，18個(gè)類群共有4300個(gè)基本科，其次是兩個(gè)類群的2990個(gè)科和786個(gè)物種特異性科（圖6A和B ））。大約 59.6% 的檢測到的基因?qū)儆诠蚕砑易澹渲?1,544 個(gè)家族具有單拷貝基因。值得注意的是，上一部分提到的效應(yīng)子PKS（EVM0010851.1）聚集在一個(gè)共享家族（GF2338）中，在Pfam注釋中具有特征性的酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。

其他三種密切相關(guān)的 FSSC 物種F. falciforme、F. solani和F. vanettenii的基因組被用作參考基因組來探索 CRI 24-3 的選擇壓力。分別確定了 CRI 24-3 與?F. falciforme、F. solani?和F. vanettenii?之間的 2265、2272 和 2272 直系同源物對的非同義替換率 (Ka) 與同義替換率 (Ks) 的比率（ 圖 6C 至 E)。Ka /Ks總體分析的值小于 1，表明 CRI 24-3 中的大多數(shù)直系同源物似乎都經(jīng)過了純化選擇并且高度保守。然而，CRI 24-3 和F. falciforme基因組的比較確定了一個(gè)快速進(jìn)化基因?qū)Γ‥VM0014458.1 與 GE10416_g）的 Ka /Ks比率大于 1，表明陽性選擇可能發(fā)生在進(jìn)化。基因組共線性分析表明，F. vanettenii和F. oxysporum基因組中的幾個(gè)染色體片段在 CRI 24-3 中濃縮成一個(gè)片段，并有一些倒位（圖 6F ）。此外，CRI 24-3 中的一些直系同源物具有多對一的關(guān)系。CRI 24-3 中至少有兩個(gè)查詢基因與參考物種中的相同直系同源物匹配。值得注意的是，CRI 24-3 的重要基因組區(qū)域不能與尖孢鐮刀菌基因組中的那些共線性耦合，由 35.9% 的共線性率（共線直系同源物對與所有直系同源物對的比率）支持，該比率低于CRI 24-3 和F. vanettenii?(77.6%)。結(jié)果表明，CRI 24-3在系統(tǒng)發(fā)育上與尖孢鐮刀菌相距較遠(yuǎn)。MAT基因座對于在鐮刀菌屬中產(chǎn)生子囊孢子至關(guān)重要。在此，交配型結(jié)構(gòu)組織 ( MAT ) 基因座在基于簡化的共線性分析比較了茄科鐮孢菌CRI 24-3、禾谷鐮刀菌PH-1 和F. vanettenii?77-13-4（圖 7）。與僅攜帶 MAT1-1 基因的?F. vanettenii?77-13-4相比， CRI 24-3 含有MAT1-1和MAT1-2獨(dú)特型基因，在單個(gè)MAT基因座處與禾谷鐮刀菌密切相關(guān)，除了 CRI 24-3 是 MAT1-2-3 缺陷型。只有位于 CRI 24-3 中 MAT1-2-1 上游區(qū)域的沒有任何特征功能域的片段與禾谷鐮刀菌中的 MAT1-2-3 具有序列相似性。

總? 結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)了一種新型鐮刀菌病害，可導(dǎo)致甘薯根和莖腐爛。致病因子F. solani-melongenae分離株 CRI 24-3 的基因組測序。該結(jié)果將指導(dǎo)其他密切相關(guān)的鐮刀菌基因組序列的組裝。對已測序的 FSSC 成員的基因組進(jìn)行全面的基因組比較分析，可以提高對 FSSC 甚至整個(gè)屬的遺傳特征的理解。此外，進(jìn)一步分析促進(jìn)植物感染的毒力因素將為制定鐮刀菌病害管理策略提供基礎(chǔ)，從而大限度地減少經(jīng)濟(jì)損失。

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