空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)識(shí)別蘭花早期發(fā)育的多種細(xì)胞類型并揭示其發(fā)育過(guò)程。

近日，Nucleic acids research（IF=19.160）在線發(fā)表了由復(fù)旦大學(xué)戚繼研究員團(tuán)隊(duì)和江西農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)春策教授團(tuán)隊(duì)合作完成的研究論文“A spatiotemporal atlas of organogenesis in the development of orchid flowers”。本研究應(yīng)用10x Visium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)蘭科植物蝴蝶蘭（Phalaenopsis?Big Chili）的花器官的發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了研究。通過(guò)分析數(shù)千個(gè)與花發(fā)育相關(guān)基因的空間表達(dá)分布，高分辨率地識(shí)別了蘭花早期發(fā)育的多種細(xì)胞類型。百邁客有幸參與此項(xiàng)研究工作，為該研究提供了空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序服務(wù)。接下來(lái)，我們一起來(lái)看一下這篇文章講了一個(gè)怎樣的精彩故事。

研究背景

花器官的發(fā)育是被子植物中特有的一個(gè)神秘過(guò)程，涉及到細(xì)胞在特定位點(diǎn)的生長(zhǎng)、分裂和分化以及細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用等一系列細(xì)胞活動(dòng)。典型的高等植物花器官一般可以分為四輪結(jié)構(gòu),從外向內(nèi)依次是萼片、花瓣、雄蕊和心皮。而控制花的四輪結(jié)構(gòu)發(fā)育的就是典型的“ABC”模型，MADS-box基因在其中起著非常重要的作用。

蘭科是被子植物中較大的科之一，有763屬，28,000多個(gè)種，被認(rèn)為是研究花器官發(fā)育和進(jìn)化的模式科。然而，對(duì)蘭花花發(fā)育復(fù)雜過(guò)程的全面認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，特別是缺乏對(duì)其器官發(fā)生關(guān)鍵調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的時(shí)空研究。

研究思路

研究結(jié)果

1、蘭花花器官早期發(fā)育的空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和細(xì)胞類型識(shí)別

為了提供花器官發(fā)生的時(shí)空細(xì)胞圖譜，以便全面理解器官發(fā)生的復(fù)雜過(guò)程，本研究在10×?Visium平臺(tái)上對(duì)蝴蝶蘭(P. Big Chili)三個(gè)總狀花序組織樣本的矢狀面進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，從時(shí)期上覆蓋了花序分生組織存在到接近成熟的花器官的大部分早期發(fā)育階段（圖1A）。研究團(tuán)隊(duì)利用自主開發(fā)的STEEL算法，將空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)清晰地分為40個(gè)clusters（圖1B、C）。其中，花被片、唇瓣和花柱組織中的beads聚類性較好，且與相應(yīng)的組織形態(tài)學(xué)檢測(cè)的觀察結(jié)果高度一致。 總之，三張切片的空間轉(zhuǎn)錄組共檢測(cè)到14,328個(gè)基因的表達(dá)，其中有3,817個(gè)基因被鑒定為特異性或優(yōu)先在一個(gè)或多個(gè)組織中表達(dá)，為后續(xù)詳細(xì)分析從分生組織細(xì)胞到分化后細(xì)胞的細(xì)胞類型變化提供了分子圖譜。

圖1?基于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的蘭花早期發(fā)育階段器官發(fā)生的重建

2.早期花原基存在分生組織細(xì)胞，隨后分化為營(yíng)養(yǎng)型細(xì)胞和生殖細(xì)胞

為了研究從分生組織細(xì)胞到營(yíng)養(yǎng)型細(xì)胞(花被、唇瓣)和生殖細(xì)胞(花柱)的分化，研究團(tuán)隊(duì)用Monocle繪制了細(xì)胞狀態(tài)的軌跡。如圖2B所示，三簇分生組織細(xì)胞形成了一條連續(xù)的路徑，代表其發(fā)育過(guò)程，與其在組織學(xué)切片上的位置高度一致。該路徑分為兩條子路徑：一條是由花被片中的營(yíng)養(yǎng)型細(xì)胞組成，另一條由花柱中的花藥原基生殖細(xì)胞組成。細(xì)胞類型變化的軌跡作為動(dòng)態(tài)發(fā)育過(guò)程的靜態(tài)投影，也可以理解為分生組織細(xì)胞的擬時(shí)序分化。如圖2C所示，此時(shí)營(yíng)養(yǎng)型細(xì)胞出現(xiàn)較早，并分散在子路徑的遠(yuǎn)端。共鑒定出4,685個(gè)空間差異基因與發(fā)育擬時(shí)間相關(guān)，對(duì)這些基因繪制分支軌跡基因表達(dá)熱圖，發(fā)現(xiàn)它們隨著發(fā)育路徑的分離表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式（圖2D）。MapMan功能富集圖顯示它們主要富集在細(xì)胞壁代謝、激素、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和RNA合成等功能上（圖2E）。通過(guò)基因的擬時(shí)分布圖發(fā)現(xiàn)許多其他基因可能在分生組織、營(yíng)養(yǎng)組織和生殖組織的細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮作用(圖2F)。

圖2?分生組織細(xì)胞向營(yíng)養(yǎng)型細(xì)胞和生殖細(xì)胞的分化

3.MADS-box基因的空間表達(dá)分布說(shuō)明了決定蘭花花部器官的ABC code

為了發(fā)現(xiàn)蘭花中特異的ABC code，本研究對(duì)7種被子植物的MADS-box基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。在蝴蝶蘭中的21個(gè)ABCDEG類MADS-box基因中，有15個(gè)基因在空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集上檢測(cè)到表達(dá)信號(hào)，且在不同組織部位呈現(xiàn)出優(yōu)先或特異的表達(dá)模式（圖3）。其中，AP3-like和PI-like基因(B類基因)均在花被片、唇瓣和花柱的原基中表達(dá)。特別是PAXXG070630在花柱頂端組織周圍表現(xiàn)出梯度表達(dá)信號(hào)，其中單個(gè)spot點(diǎn)表達(dá)量高，其周圍細(xì)胞的表達(dá)信號(hào)隨著離中心spot點(diǎn)的距離增大而減弱，表明花藥在發(fā)育的這一階段是從單個(gè)spot點(diǎn)開始的。AG-like（C類基因）的空間表達(dá)譜上也存在類似的情況，為花藥的器官發(fā)生提供了進(jìn)一步的證據(jù)。而AP1-like基因（A類基因）優(yōu)先表達(dá)于分生組織中或廣泛表達(dá)于各器官中，AGL6-like（G類基因）則在唇瓣和花被片中特異表達(dá)。

4.持續(xù)激活的分生組織細(xì)胞群參與花被片的形成

通過(guò)對(duì)被片細(xì)胞進(jìn)行發(fā)育軌跡分析，發(fā)現(xiàn)5號(hào)花苞被片細(xì)胞處于發(fā)育軌跡*遠(yuǎn)端，基因表達(dá)呈現(xiàn)出高度一致性。而6號(hào)花苞被片細(xì)胞由4個(gè)亞群組成,顯示出細(xì)胞之間的高度異質(zhì)性。如圖4A所示，發(fā)育軌跡分析顯示，發(fā)育起始于基部分生組織細(xì)胞（cluster22、cluster27），然后路徑分散為在近期分化(cluster1)和早期分化(cluster2)的被片細(xì)胞。擬時(shí)序分析表明細(xì)胞狀態(tài)從分生組織到近期分化細(xì)胞再到早期分化細(xì)胞的持續(xù)變化(圖4B、C)。通過(guò)對(duì)6號(hào)花苞分生組織細(xì)胞群和分化早期、近期的被片細(xì)胞群中檢測(cè)到的987個(gè)基因，繪制分支軌跡基因表達(dá)熱圖，發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)水平與組織部位呈現(xiàn)高度相關(guān)性（圖4D）。分生組織、被片組織優(yōu)先表達(dá)的基因顯著富集在蛋白質(zhì)合成、光合作用和細(xì)胞壁合成等相關(guān)途徑上（圖4E）。

圖4?切片1中6號(hào)花苞的分生組織細(xì)胞向花被片細(xì)胞分化的分析

5.花藥發(fā)育的起始和隨后多種細(xì)胞類型的分化

與花被、唇瓣這類營(yíng)養(yǎng)組織不同，花藥的發(fā)育起始時(shí)間更晚，過(guò)程也更為復(fù)雜。花藥起始于花柱頂端的花藥原基，如圖2A所示，spot點(diǎn)中B-和C-功能基因表達(dá)呈現(xiàn)高表達(dá)。與此同時(shí)，許多下游基因被激活，用于進(jìn)一步的形態(tài)建成過(guò)程。例如，在6號(hào)花苞的花藥中心出現(xiàn)花粉塊，之后在7號(hào)和8號(hào)花苞中可以觀察到它的形狀變化過(guò)程（圖5A）。為了進(jìn)一步探究花藥發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化，收集了花藥原基或花粉上優(yōu)先表達(dá)的1,683個(gè)基因進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)不同花苞之間存在不同的表達(dá)模式。正如如圖5B所示，在5號(hào)花苞和8號(hào)花苞中分別有123和141個(gè)基因高表達(dá)。而其中大部分基因呈現(xiàn)從5號(hào)花苞到8號(hào)花苞整體減少的表達(dá)模式。展示了與蘭花生殖相關(guān)營(yíng)養(yǎng)型細(xì)胞中特異表達(dá)或優(yōu)先表達(dá)的一系列關(guān)鍵基因，顯示了花藥發(fā)育過(guò)程中表達(dá)譜的動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)對(duì)三個(gè)樣本的120個(gè)clusters進(jìn)行PCA分析，表明花藥的早期營(yíng)養(yǎng)組織，雖然存在相似的基因表達(dá)模式，沒有表現(xiàn)出特異表達(dá)的基因，但在發(fā)育后期迅速經(jīng)歷了分化和形態(tài)建成過(guò)程（圖5C）。

圖5?花藥多發(fā)育階段的身份決定與形態(tài)建成

總? 結(jié)

本研究利用10x Visium空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析了蝴蝶蘭花器官早期發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。通過(guò)對(duì)時(shí)空表達(dá)分布的比較，確定了在特定組織/階段優(yōu)先表達(dá)的數(shù)千個(gè)基因，包括MADS-box基因和許多其他潛在下游基因，形成了花器官初始化、身份決定和形態(tài)建成的模型。對(duì)蘭花開花發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，為進(jìn)一步研究蘭花開花過(guò)程中復(fù)雜而重要的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了寶貴的資源。

百邁客空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)

百邁客空間轉(zhuǎn)錄組已在近百種物種上積累大量經(jīng)驗(yàn)，建立了成熟的植物組織透化體系，主要包括莖、芽、花、根、種子等組織類型，部分項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)詳情展示如下：

除了10x空間轉(zhuǎn)錄組項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)和植物切片結(jié)果外，百邁客還有百創(chuàng)S1000空間轉(zhuǎn)錄組的實(shí)測(cè)高清結(jié)果圖片供欣賞百創(chuàng)S1000的優(yōu)勢(shì)有：

• 亞細(xì)胞級(jí)分辨率
• 多級(jí)分辨率動(dòng)態(tài)分析
• 1-8樣本，靈活上樣
• 兼容HE/甲苯胺藍(lán)染色，保留組織原始形態(tài)

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參考文獻(xiàn)

Liu C, Leng J, Li Y, Ge T, Li J, Chen Y, Guo C, Qi J. A spatiotemporal atlas of organogenesis in the development of orchid flowers. Nucleic Acids Res. 2022 Sep 12:gkac773.