單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序在植物中的應(yīng)用實(shí)例及研究

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在科研工作中，您是否遇到過以下問題？

我想做單細(xì)胞測序，但是樣品在野外采摘，只能凍存或干燥保存，難以用新鮮組織開展單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。

聽說做單細(xì)胞測序需要制備原生質(zhì)體，實(shí)驗(yàn)室嘗試很久都無法成功制備原生質(zhì)體。

制備原生質(zhì)體過程需要酶消化且制備時間很長，可能會觸發(fā)應(yīng)激反應(yīng)，影響轉(zhuǎn)錄表達(dá)的真實(shí)結(jié)果。

我的樣本部分細(xì)胞直徑大于40 μm，無法被市面上大部分的儀器平臺捕獲。

為了有效解決植物單細(xì)胞目前研究的桎梏，單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序（single-nuclei RNA sequencing，snRNA-seq）應(yīng)運(yùn)而生。它是指通過提取細(xì)胞核，從而在單細(xì)胞水平研究基因表達(dá)的技術(shù)。

技術(shù)原理

單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)（snRNA-seq）不同于常規(guī)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq），不需要進(jìn)行原生質(zhì)體的制備，而是對組織進(jìn)行切割/研磨破碎。之后利用百邁客優(yōu)化細(xì)胞核分離試劑盒提取，清洗和重懸；再通過10x genomics單細(xì)胞測序平臺利用微流控、油滴包裹和barcode標(biāo)記等技術(shù)來實(shí)現(xiàn)高通量的單細(xì)胞核捕獲，構(gòu)建單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組文庫，借助Illumina測序平臺對文庫進(jìn)行測序檢測，即可一次性獲得大量單細(xì)胞核的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，從而實(shí)現(xiàn)復(fù)雜組織或珍貴冷凍樣本在單細(xì)胞水平進(jìn)行基因表達(dá)測序。

圖1 番茄莖尖核提取流程及核形態(tài)展示（Tian C et al. 2020）

技術(shù)優(yōu)勢

1. 操作性強(qiáng)：無需制備原生質(zhì)體，提高實(shí)驗(yàn)效率，縮短實(shí)驗(yàn)周期。

2. 更少干擾：避免原生質(zhì)體制備過程誘導(dǎo)應(yīng)激基因表達(dá)，減少“轉(zhuǎn)錄偏好”。

3. 輕松取材：可以實(shí)現(xiàn)凍存樣品研究，樣品保存和運(yùn)輸更便捷！

4. 結(jié)果可靠：基因檢出率、細(xì)胞分群的結(jié)果與scRNA-seq趨于一致。

5. 兼容性強(qiáng)：可以開展更大尺寸的細(xì)胞研究，避免丟失重要信息。

應(yīng)用案例

案例一

題目：玉米單核RNA測序揭示調(diào)控氣孔運(yùn)動和發(fā)育的信號網(wǎng)絡(luò)

期刊：The Plant Cell?[IF: 12.085]?2022.2.15

發(fā)表單位：河南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

樣本設(shè)計(jì)：玉米葉基（n=1）、玉米果皮snRNAseq（n=3）、WT（n=4）和bzu2-1突變體（n=3）玉米葉bulk RNA-seq

主要研究結(jié)果：

植物氣孔的獨(dú)特形態(tài)使其能夠快速響應(yīng)環(huán)境變化，了解氣孔運(yùn)動和發(fā)育的機(jī)制對于保障糧食安全至關(guān)重要。本研究從玉米葉基和果皮組織的33,098個核中鑒定發(fā)育和成熟時期氣孔的細(xì)胞類型。通過與MUTE缺陷突變體氣孔發(fā)育的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)比較，確定了玉米組織氣孔發(fā)育的軌跡，并闡明了氣孔發(fā)育的關(guān)鍵參與因素。本研究為進(jìn)一步深入了解單子葉植物的氣孔功能提供了有價值的、全面的基礎(chǔ)研究。

案例二

題目：基于單核轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)空間重建的擬南芥花分生組織3D基因表達(dá)圖譜

期刊：Nature?Communication?[IF: 17.694]?2022.5.20

發(fā)表單位：柏林洪堡大學(xué)生物學(xué)研究所

樣本設(shè)計(jì)：擬南芥花序發(fā)育的第5階段（DEX誘導(dǎo)后4天）、第4階段（DEX誘導(dǎo)后3天）的花分生組織snRNA-seq以及FANS分選AP3-(n=3)、AG-(n=3)樣本的細(xì)胞核進(jìn)行bulk RNA-seq

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)以分辨率表征發(fā)育器官中的基因表達(dá)異質(zhì)性。然而，在這種方法中，細(xì)胞的原始物理位置丟失了。在植物中，恢復(fù)發(fā)育器官中細(xì)胞的原始位置是將基因活性與細(xì)胞特性和功能聯(lián)系起來的關(guān)鍵。本研究從擬南芥花分生組織的7,716個細(xì)胞核中鑒定出12個主要的細(xì)胞類型。之后將單核轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與基于顯微復(fù)制的三維空間重建，重建了三維花分生組織中單個細(xì)胞的全基因組基因表達(dá)模式，展現(xiàn)了空間重建的3D單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜在理解植物形態(tài)建成方面的能力。

圖3 擬南芥花分生組織的單核RNA測序

總 結(jié)

與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組相比，植物單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組在保證高效捕獲分選單細(xì)胞數(shù)據(jù)的同時，減少了應(yīng)激基因表達(dá)影響、胞質(zhì)內(nèi)代謝物的干擾。并可兼容更大細(xì)胞直徑，獲得更全面信息。也為特殊樣本進(jìn)行單細(xì)胞測序提供了新的解決方案，為進(jìn)一步推動植物單細(xì)胞研究提供重要的技術(shù)支撐。

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