單細胞全基因組測序（scWGS）重新揭秘阿爾茨海默病神經(jīng)元的體細胞突變

阿爾茨海默氏?。ˋD）是一種常見、進行性和致命的與年齡相關的神經(jīng)退行性疾病，其特征是神經(jīng)元丟失和錯誤折疊蛋白質的定型沉積，但AD中細胞功能障礙的核心基礎尚不清楚，AD尚未在單個細胞基因組層面進行檢查。本期我們一起來追尋對AD和神經(jīng)典型對照個體大腦的單個神經(jīng)元應用了單細胞全基因組測序（scWGS）組學技術在遺傳疾病方面的應用，希望能給大家對AD的研究帶來新的思路。

研究背景

阿爾茨海默氏癥的癡呆癥隨著神經(jīng)變性的進展而發(fā)展，但導致神經(jīng)元功能障礙和死亡的具體事件仍然鮮為人知。在正常衰老期間，神經(jīng)元以類似于分裂細胞的速度逐漸積累軀體突變，這表明遺傳因素、環(huán)境暴露或疾病狀態(tài)可能會影響這種積累在這里，本文分析了來自阿爾茨海默病患者和神經(jīng)典型對照個體前額葉皮層和海馬體的319個神經(jīng)元的單細胞全基因組測序（scWGS）數(shù)據(jù)。發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默氏癥患者的體細胞DNA改變增加，分子模式不同，正常神經(jīng)元主要以與年齡相關的模式（特征A）積累突變，這與之前在健康和癌細胞中描述的“時鐘狀”突變特征非常相似。神經(jīng)變性中DNA改變的異常積累為阿爾茨海默病發(fā)展過程中發(fā)生的分子和細胞事件的級聯(lián)提供了見解。

材料方法

材料：年輕的神經(jīng)典型對照組（9人）、老年神經(jīng)典型對照組（11人）、阿爾茨海默氏病患者（9人）；一共29人，總計：319個神經(jīng)元，172個PFC-MDA神經(jīng)元，78個HC-MDA神經(jīng)元，69個PFC-PTA神經(jīng)元

方法：對319個神經(jīng)元進行單細胞全基因組測序。

研究結論

AD患者大腦中的興奮性神經(jīng)元積累的基因組損傷——以及可能的永久性突變——超過了僅因衰老而發(fā)生的水平。AD神經(jīng)元中基因組SNV積累的模式似乎與正常衰老的加重不同，這表現(xiàn)為（1）特征C的豐富，特征C存在于神經(jīng)典型對照個體的大腦中，但有限；（2）特征特異性轉錄影響。這些基因組變化可能包括一系列表現(xiàn)形式，包括單鏈DNA病變和雙鏈突變。AD神經(jīng)元體細胞改變的具體模式還提供了關于其原因和AD發(fā)病機制潛在影響的線索并確定潛在的治療目標，scWGS技術深度揭示AD疾病發(fā)病機制與體細胞突變的積累有關，為其治療提供了理論基礎。

主要研究結果

1、衰老期間神經(jīng)元的體細胞突變

對從AD和神經(jīng)典型對照個體的大腦中分離出來的神經(jīng)元進行了單細胞全基因組測序（scWGS），染色了泛神經(jīng)元標記NeuN來標記神經(jīng)元，并進一步只標記了大的NeuN陽性核，使用多位移放大（MDA）進行全基因組擴增，分析了8例AD的91個神經(jīng)元和18個神經(jīng)典型對照組的159個神經(jīng)元。在神經(jīng)典型個體中，神經(jīng)元sSNVs隨著年齡的增長而增加，sSNVs的年增長率相當高，從每年13到55個sSNV不等，在一些特殊細胞類型中，分裂突變率更高。沒有神經(jīng)診斷的個體的海馬CA1神經(jīng)元顯示，隨著年齡的增長，sSNVs呈積累的趨勢，這與神經(jīng)典型對照個體前額葉皮層（PFC）神經(jīng)元中看到的sSNV的增加沒有顯著差異。

在正常的PFC神經(jīng)元中，與年齡相關的突變增加主要由某些C>T和T>C變化驅動，從PFC和海馬錐體神經(jīng)元的復合數(shù)據(jù)集中對sSNVs進行簽名分解分析表明，簽名A在每個神經(jīng)元中的貢獻隨著年齡的增長而增加，每年獲得15.0±1.2 sSNVs。這種與年齡相關的特征A突變的增加與PFC和海馬錐體神經(jīng)元相似（P = 0.18，線性混合模型），并且是正常神經(jīng)元中與年齡相關的sSNV積累的主要驅動因素。轉錄可以通過轉錄相關損傷或無效修復使表達的位點對軀體突變敏感。

2、AD中的體細胞突變特征分析

評估了8名AD患者大腦神經(jīng)元中sSNVs的負擔，發(fā)現(xiàn)AD神經(jīng)元sSNVs明顯高于預期。AD神經(jīng)元在MDA實驗中也顯示sSNVs顯著增加。在PFC中，在八例AD個體病例中觀察到AD中sSNVs相對于正常衰老的顯著增加。AD中sSNV計數(shù)高的幾個基因組來自海馬體，其中8例中有5例與正常衰老相比，sSNVs顯著增加。AD中的神經(jīng)元包含數(shù)百種額外的sSNV，超出了其年齡的預期，這表明該疾病過程產(chǎn)生的基因組損傷水平與十多年來sSNV的正常積累相當。變異的廣泛基因組分布表明，體細胞突變不是構成疾病發(fā)病機制的特定初始事件，而是繼發(fā)性的，這是由引發(fā)AD和誘變過程的其他事件引起的。

AD神經(jīng)元的突變特征分析，在所有樣本中，A突變都會隨著年齡的增長而增加，這表明這種時鐘狀特征（與癌癥5的時鐘樣特征SBS5最相似）構成了基因組老化的固有特征。簽名A還顯示，相對于年齡匹配的控制，AD略有增加，這在這些MDA實驗中沒有達到統(tǒng)計學意義，但表明這些突變機制在疾病環(huán)境中可能會被強調。另一方面，AD神經(jīng)元與對照組相比，簽名C明顯增加。鑒于AD4.31-33中報告了活性氧（ROS）和氧化核酸病變的增加，在AD中積累標志性C的合理機制是，氧化損傷的增加壓倒了NER，而NER也可能在AD中也會減弱。

由于我們的突變特征分析表明，DNA氧化——之前在AD4.11患者大腦的批量分析中觀察到——可能會導致AD中過量的sSNV，使用針對8-oxoG的抗體進行免疫熒光顯微鏡顯示，AD神經(jīng)元中的8-oxoG水平明顯高于神經(jīng)典型對照神經(jīng)元。表明氧化核苷酸損傷水平的增加有助于C>A變化和AD神經(jīng)元中標志性C的增加。

對神經(jīng)元功能和生存至關重要的基因突變可能會直接影響細胞適應性，對于簽名A，轉錄期間的事件似乎在產(chǎn)生突變方面發(fā)揮作用，而簽名C與表達式成反比，因此可以在轉錄期間更有效地修復，包括通過TC-NER35修復。對AD和對照神經(jīng)元中位突變的基因本體學（GO）分析顯示，參與神經(jīng)元功能的基因被sSNVs豐富。當與表達式-sSNV結果一起考慮時，AD神經(jīng)元顯示轉錄過程對突變生成的影響，這種轉錄影響可以在配對的DNA鏈上產(chǎn)生不對稱的突變模式。

在蛋白質編碼基因中，AD神經(jīng)元表現(xiàn)出比年齡匹配的對照神經(jīng)元表現(xiàn)出更多的非同義突變，對AD37腦脊液和腦組織中的克隆CD8+ T細胞的觀察表明，這種自激活可能與AD有關。功能失調的神經(jīng)元在AD中會明顯更豐富，這可能會因某些AD相關基因的長度而加??；因此損害神經(jīng)元功能可能是sSNVs影響細胞生理學的一種方式。

3、PTA擴增對AD神經(jīng)元基因組突變特征分析

基于PTA（初級模板定向放大）的人類神經(jīng)元scWGS證實，體細胞突變隨著年齡的增長而增加。對MDA分析的大多數(shù)大腦的神經(jīng)元小樣本（來自7例AD的29個神經(jīng)元和13個神經(jīng)典型對照組的40個神經(jīng)元）進行了基于PTA的scWGS，并確認AD神經(jīng)元與對照組相比包含更多的改變，PTA檢測到的sSNVs代表雙鏈體細胞突變。
PTA檢測到的突變，這再次證實了簽名A突變以時鐘般的方式隨著年齡的增長而增加，AD神經(jīng)元中的簽名A略有顯著增加（P = 0.04，線性混合模型）。AD神經(jīng)元總突變的增加一樣，PTA突變特征發(fā)現(xiàn)反映了MDA放大神經(jīng)元基因組的趨勢。其中包括SBS8和SBS30，它們與DNA修復酶NTHL1有關，NTHL1參與氧化性病變修復。轉錄區(qū)域PTA檢測到的sSNVs負荷與大腦中的基因表達水平相關，而簽名A和C突變顯示的模式與MDA檢測到的sSNV相似，指出轉錄活動對突變發(fā)生的特殊影響。因此，兩種scWGS方法都確定了類似的模式，并表明AD中的致病突變機制包括DNA氧化、NER DNA修復和轉錄活性。

總結

兩種不同的單細胞全基因組測序技術揭示了AD患者大腦中的興奮性神經(jīng)元積累的基因組損傷——以及可能的永久性突變——超過了僅因衰老而發(fā)生的水平，未來探索更多的體細胞突變模式解釋這些氧化性病變如何通過與衰老過程中發(fā)生的突變相互作用來損害基因組功能。

如果您對單細胞全基因組測序感興趣，歡迎點擊下方按鈕聯(lián)系我們，我們將免費為您設計文章思路方案。