納米藥物在腫瘤治療中的應(yīng)用文獻(xiàn)案例

2022年8月，中國科學(xué)院國家納米科學(xué)中心聶廣軍教授和趙瀟教授團(tuán)隊在《Advanced Materials》（IF：32.086）發(fā)表了研究成果“Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Controllable Two-Way Adaptors to Activate Macrophage Phagocytosis for Improved Tumor Immunotherapy”，報道了納米藥物工程細(xì)菌外膜囊泡通過激活巨噬細(xì)胞刺激抗腫瘤免疫機(jī)制，百邁客生物為該研究提供了轉(zhuǎn)錄組測序分析服務(wù)。

文獻(xiàn)研究背景

細(xì)菌衍生的外膜囊泡（OMV）是高免疫原性納米囊泡，已經(jīng)成為腫瘤免疫治療常用的傳遞載體；巨噬細(xì)胞作為腫瘤微環(huán)境（TME）中的抗原遞呈細(xì)胞，可以處理被吞噬的腫瘤細(xì)胞，并將腫瘤抗原呈遞給T細(xì)胞，從而激活抗原特異性免疫反應(yīng)，腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出CD47“don’t eat me”信號的高表達(dá)，阻礙了巨噬細(xì)胞的吞噬作用；腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）與免疫抑制性M2極化巨噬細(xì)胞非常相似，與腫瘤免疫逃逸和腫瘤進(jìn)展有關(guān)，TAMs的jing q高效激活是一種非常有前景的腫瘤免疫治療方法。

文獻(xiàn)材料方法

材料設(shè)計

CD47納米抗體（CD47nb）融合到OMV表面（OMV-CD47nb），OMV-CD47nb可以同時與腫瘤細(xì)胞的CD47和TAMs的TLRs結(jié)合；外表面涂有含有二烯酰胺鍵（PEG/Se）的聚乙二醇（PEG）層，形成PEG/Se@OMV-CD47nb，PEG/Se層的修飾可以減輕了OMV-CD47nb的免疫原性，顯著提高給藥劑量；

分組設(shè)計

構(gòu)建PBS、PGE/Se@OMV-CD47nb+RA和anti-CD47處理的皮下成瘤小鼠模型，利用流式細(xì)胞術(shù)FACS分選巨噬細(xì)胞，進(jìn)行RNA-seq。

文獻(xiàn)研究思路

研究結(jié)論

• 改造的納米藥物工程細(xì)菌OMV-CD47nb在腫瘤部位進(jìn)行局部放射治療時，可以安全有效地精準(zhǔn)釋放到TME中；
• OMV-CD47nb通過多種途徑激活TAM吞噬作用，包括誘導(dǎo)M1極化和阻斷“don’t eat me”信號；
• TAM的激活通過有效的抗原呈現(xiàn)來刺激T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫。

文獻(xiàn)主要研究結(jié)果

1、OMV-CD47nb對體外巨噬細(xì)胞的影響

分別用PBS、OMVs、OMVs+CD47nb混合物、OMV-CD47nb和anti-CD47，處理B16-GFP細(xì)胞2h（綠色熒光蛋白的小鼠黑色素瘤細(xì)胞 B16-GFP），然后將處理后的細(xì)胞與M0型BMDMs、M1型BMDMs共培養(yǎng)。結(jié)果顯示，OMV-CD47nb共培養(yǎng)2h后，M1型BMDMs組中GFP+細(xì)胞比例大于M0型BMDMs組（圖1C, D），表明M1型BMDMs與M0型BMDMs相比具有更高的吞噬活性，熒光成像也觀察到吞噬突觸（圖1E）；OMVs+CD47nb混合物沒有誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞吞噬作用，表明OMV-CD47nb能有效介導(dǎo)巨噬細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的相互作用。

OMVs和OMV-CD47nb處理，顯著提高了M0型BMDMs和M2型BMDMs中CD86+、MHC Ⅱ+、CD40+細(xì)胞比例（M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物），顯著抑制了M1型BMDMs和M2型BMDMs中CD206+細(xì)胞比例）（M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物）（圖1F）；ELISA實(shí)驗結(jié)果證實(shí)，OMVs和OMV-CD47nb處理后的M0型和M2型BMDMs，促進(jìn)了促炎細(xì)胞因子如IL-1β、TNF-α、IL-12和IL-6的表達(dá)，抑制了抗炎細(xì)胞因子IL-4的表達(dá)（圖1G）。以上結(jié)果表明，OMVs和OMV-CD47nb能夠促進(jìn)體外巨噬細(xì)胞的M1型極化。

2、PEG/Se@OMV-CD47nb具有抗腫瘤和TME重塑作用

分別構(gòu)建PBS、PEG/Se@OMV-CD47nb、RA（局部放射治療）、PEG/Se@OMV+RA、PEG/Se@OMV-CD47nb+RA、anti-CD47處理的MC38-OVA皮下成瘤小鼠模型（表達(dá)卵清蛋白的MC38小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系），評估抗腫瘤效果（圖2A）。結(jié)果顯示，90天后，PEG/Se@OMV-CD47nb+RA組小鼠存活率100%，PEG/Se@OMV+RA組小鼠存活率33.3%，其余組小鼠均全部死亡（圖2B）；單獨(dú)RA與PEG/Se@OMV-CD47nb處理沒有引起明顯的抗腫瘤活性，而RA與PEG/Se@OMV-CD47nb聯(lián)合顯示出顯著的抗腫瘤效果，但并且與臨床上使用的陽性對照anti-CD47相比，CD47nb的抗腫瘤作用更強(qiáng)（圖2C）。

利用流式分選評估治療后TME中腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果顯示，相較于PBS組，PEG/Se@OMV-CD47nb+RA組顯著增加了F4/80巨噬細(xì)胞與F4/80 CD86 M1型巨噬細(xì)胞的比例，并減少了F4/80 CD206 M2型巨噬細(xì)胞的比例（圖2D）；PEG/Se@OMV-CD47nb+RA處理組上調(diào)了CD11C+CD80+細(xì)胞和CD11C+CD86+細(xì)胞的比例，表明激活了TME中樹突狀細(xì)胞DC的成熟（圖2E）；PEG/Se@OMV-CD47nb+RA組還招募了大量的CD45+CD49B+NK細(xì)胞、CD45+CD19+B細(xì)胞和CD11B+Ly6G 中性粒細(xì)胞進(jìn)行腫瘤組織。以上結(jié)果表明，OMV-CD47nb改變了TAMs的極化狀態(tài)，并通過招募各種免疫細(xì)胞促進(jìn)TME重塑。

3、RNA-seq分析PEG/Se@OMV-CD47nb治療后瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞表達(dá)模式變化

利用FACS分選出PBS、PGE/Se@OMV-CD47nb+RA和anti-CD47處理的皮下成瘤小鼠的瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞，進(jìn)行RNA-seq。分析結(jié)果顯示，與PBS組相比，PGE/Se@OMV-CD47nb+RA組M1型巨噬細(xì)胞maker基因表達(dá)水平上調(diào)，包括：CD80、CD86、CD38、Marco、FPR2、NOS2、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18、IL-23a、IL-27、CCL1、CXCL2、CXCL9、、CXCR3、CCL3、CCL4和CCL5，M2型相關(guān)的marker基因表達(dá)水平下調(diào)，包括：Rentla、Mrc1、SOCS2和Ppard，提示與M1型相關(guān)趨化因子的表達(dá)增加可能是招募免疫細(xì)胞進(jìn)入TEM的原因；PGE/Se@OMV-CD47nb+RA組中M1型極化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子IRF-5和Myd88表達(dá)水平上調(diào)，M2型極化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Rictor、TSC1、Klf4和Prkaa1表達(dá)水平下調(diào)（圖3A）； 相較PBS組，PGE/Se@OMV-CD47nb+RA和anti-CD47組中CD47-SIRPα信號通路下游分子SHP2表達(dá)水平下調(diào)，可能與CD47的阻斷作用有關(guān)（圖3B）。

與PBS組相比，PGE/Se@OMV-CD47nb+RA組中的VEGFA、VEGFB、HGF、PDGFA、MMP2、MMP9、MMP10和MMP11表達(dá)水平下調(diào)（圖3C），這些基因與TAMs促進(jìn)腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移相關(guān)；此外，多種MHC Ⅰ、MHC Ⅱ類分子表達(dá)水平顯著上調(diào)，表明腫瘤細(xì)胞的吞噬和抗原呈遞可能發(fā)生在TAMs中。

4、OMV-CD47n激活了長期的免疫記憶

為了確定通過輻射觸發(fā)的OMV-CD47nb傳遞是否能激活免疫記憶，對構(gòu)建好的PEG/Se@OMVs+RA、PEG/Se@CD-CD47nb+RA處理的MC38-OVA和B16-OVA皮下成瘤小鼠進(jìn)一步分析（圖4A）。結(jié)果顯示，PEG/Se@OMVs+RA和PEG/Se@CD-CD47nb+RA處理的MC38-OVA小鼠腫瘤沒有生長，達(dá)到100%的腫瘤抑制率（圖4B），但PEG/Se@OMVs+RA和PEG/Se@CD-CD47nb+RA處理的B16-OVA組分別達(dá)到了 91.2%和98.2%的肺部轉(zhuǎn)移抑制率（圖4C, D）；與對照組相比，PEG/Se@OMVs+RA和PEG/Se@CD-CD47nb+RA治療得小鼠血液和脾臟的中央記憶型T細(xì)胞和效應(yīng)記憶T細(xì)胞比例顯著上調(diào)（圖4E, F）；PEG/Se@OMVs+RA組中記憶T細(xì)胞比例略高于PEG/Se@CD-CD47nb+RA組，這與B16-OVA細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移抗腫瘤效果一致（圖4D）；PEG/Se@OMVs+RA和PEG/Se@CD-CD47nb+RA處理的小鼠脾臟細(xì)胞仍然擁有識別腫瘤抗原的能力，表現(xiàn)為OVA抗原重新刺激上調(diào)CD3+CD8+T細(xì)胞中IFNγ+細(xì)胞的比例（圖4G）。以上結(jié)果表明，PEG/Se@CD-CD47nb+RA治療誘導(dǎo)腫瘤抗原特異地適應(yīng)性免疫，激活了腫瘤抗原的免疫記憶，提供了長期的腫瘤預(yù)防效果。

研究小結(jié)

OMV-CD47nb可以同時與腫瘤細(xì)胞的CD47和TAMs的TLRs結(jié)合，誘導(dǎo)M1極化和阻斷“don’t eat me”信號，在腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞間起到橋梁作用，納米藥物有效吞噬腫瘤細(xì)胞；還可以招募各種免疫細(xì)胞，包括B細(xì)胞、NK細(xì)胞、DC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，引起小鼠腫瘤TME重塑；OMV-CD47nb介導(dǎo)的TAMs對腫瘤細(xì)胞的吞噬又發(fā)了腫瘤抗原的釋放，通過有效的抗原呈遞刺激T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫。

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參考文獻(xiàn)

Feng Q, Ma X, Cheng K, et al. Engineered Bacterial Outer Membrane Vesicles as Controllable Two-Way Adaptors to Activate Macrophage Phagocytosis for Improved Tumor Immunotherapy. Adv Mater. 2022;34(40):e2206200. doi:10.1002/adma.202206200